Name: Refinamiento de OnePot PURE y producción de ribosomas crudos para la síntesis de proteínas libres de células reproducibles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a refinar el sistema OnePOT PURE y preparar ribosomas crudos para síntesis de proteínas libre de células. Este protocolo estandarizado mejora la reproducibilidad y accesibilidad en laboratorios de biología sintética.

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<ol><li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pure+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Pure technology.</a> Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).</li>
<li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).</li>
<li>Shepherd, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li>
<li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).</li>
<li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+robust%2C+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).</li>
<li>Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OnePot+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">OnePot PURE cell-free system.</a> J Vis Exp. (172), e62625(2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+protein+expression+in+the+One-Pot+PURE+system%3A+insights+into+reaction+composition+and+translation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency.</a> ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).</li>
<li>Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+regeneration+from+pyruvate+in+the+PURE+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">ATP regeneration from pyruvate in the PURE system.</a> ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).</li>
<li>Doerr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+with+minimal+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems.</a> Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).</li>
<li>Christodoulou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteronuclear+NMR+investigations+of+dynamic+regions+of+intact+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes.</a> PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).</li>
<li>Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+all-E+coli+TXTL+toolbox+3.0%3A+new+capabilities+of+a+cell-free+synthetic+biology+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform.</a> Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).</li>
<li>Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DNA+template+preparation+on+variability+in+cell-free+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production.</a> Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).</li>
<li>Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+as+a+method+to+rapidly+screen+machine+learning-generated+protease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants.</a> ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).</li>
<li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLaohakunakorn%2C+N+%22Cell-free+3PGA+energy+solution%22">Cell-free 3PGA energy solution</a>. , Protocols.io. (2020).</li>
<li>Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+on+ribosomal+peptidyltransferase%3A+the+behaviour+of+the+inhibitor+blasticidin+S%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S.</a> Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).</li>
<li>Blaha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+functional+ribosomal+complexes+and+effect+of+buffer+conditions+on+tRNA+positions+observed+by+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy.</a> Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x YT</td><td>Sigma</td><td>Y2377-250G</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos</td><td>Sigma</td><td>LAA21-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio libre de ARNasa</td><td>Termo Científica</td><td>AM9070G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma</td><td>09718-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A8351-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) competente en E. coli</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>botella, centrífuga (Nalgene)</td><td>Termo Científica</td><td>3120-9500</td><td>Botella de copolímero de polipropileno</td></tr><tr><td>botella, vidrio (Duran) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 L</td><td>VWR</td><td>215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo Bradford, Quick Start 1x Reactivo de tinte</td><td>Bio-Rad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Termo Científica</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga, micro</td><td>Eppendorf</td><td>5424R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Columna de cromatografía</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de creatina</td><td>Sigma</td><td>27920</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas, semi micro 1,6 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>FB55147</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrógeno ortofosofofófobo disódico</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/4450/60</td><td></td></tr><tr><td>casete de diálisis, Slide-A-Lyzer G3, MWCO de 2 kDa, 15 mL</td><td>Termo Científica</td><td>A52962</td><td></td></tr><tr><td>Hidrógeno ortofosfato dipotásico anhidro anhidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/5240/60</td><td></td></tr><tr><td>TDT Sin pesa</td><td>Termo Científica</td><td>A39255</td><td></td></tr><tr><td>unidad de filtro, centrífuga MWCO Amicon Ultra 15 de 3kDa</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>cantimplor, 500 mL</td><td>VWR</td><td>214-1133</td><td></td></tr><tr><td>matraz, despejidos 2,5 L&nbsp;</td><td>Tunair</td><td>SS-5013</td><td></td></tr><tr><td>Ácido folínico</td><td>Sigma</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Fisherbrand</td><td>H/1200/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HEPES, solución 1 M pH 7,3</td><td>Termo Científica</td><td>BP299</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Sigma</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>incubadora</td><td>Eppendorf</td><td>New Brunswick Innova&reg; 42</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Termo Científica</td><td>R0392</td><td></td></tr><tr><td>Pastillas KOH</td><td>Termo Científica</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico sal hemimagnesio tetrahidrato</td><td>Sigma</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico sal monopotásica, monohidrato</td><td>Sigma</td><td>49601-500G</td><td></td></tr><tr><td>tetrahidrato de acetato de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Fluka</td><td>63020-1L</td><td></td></tr><tr><td>Montaje de agitación magnética</td><td>Estuardo</td><td>US152</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Termo Científica</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas de cargador NEBExpress Ni-NTA</td><td>NEB</td><td>S1423S</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543-1EA</td><td></td></tr><tr><td>pipeta, multicanal Eppendorf Research Plus 30-300 y micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Sello adhesivo de placa para lector de placas</td><td>ExcelScientific</td><td>STR-SEAL-PLT (Estéril)</td><td></td></tr><tr><td>Sello transpirable de placa</td><td>Starlab</td><td>E2796-3005</td><td></td></tr><tr><td>Sello de lámina de placa</td><td>ExcelScientific</td><td>FCS-25</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>BioTek</td><td>Sinergia H1</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placas</td><td>Allsheng</td><td>MBI100-4A</td><td></td></tr><tr><td>Placa, pozo 384</td><td>Termo Científica</td><td>242764</td><td></td></tr><tr><td>placa, pozo profundo 96 1 mL</td><td>Termo Científica</td><td>736-0601</td><td></td></tr><tr><td>placa, pozo profundo 96 2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>82.1972.002</td><td></td></tr><tr><td>PCR de placas y 96 pozos</td><td>Sarstedt</td><td>721,978</td><td></td></tr><tr><td>Placa, pozo óptico 96</td><td>Termo Científica</td><td>10057581</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P5405-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrógeno ortófosfato de potasio</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/4800/53</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de extracción de proteínas (BugBuster)</td><td>EMD Millipore</td><td>70584-3</td><td></td></tr><tr><td>resina de purificación de proteínas (cOmplete)</td><td>Roche</td><td>5893682001</td><td></td></tr><tr><td>Coctelero de rostería</td><td>Starlab</td><td>RM-Multi 1</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3105/70</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de sonicación, FisherBrand 15-50 mL</td><td>Termo Científica</td><td>12931181</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120</td><td></td></tr><tr><td>espectrofotómetro</td><td>Jenway</td><td>Genova Plus</td><td></td></tr><tr><td>espermidina</td><td>Sigma</td><td>S2626-1G</td><td></td></tr><tr><td>TCEP 0,5 M</td><td>Supelco</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher NTP, Tris con buffer</td><td>Termo Científica</td><td>R1481</td><td></td></tr><tr><td>ARNt de E. coli MRE600</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Formedium</td><td>TRP02</td><td></td></tr><tr><td>tubo, grado PCR de 0,2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72,737,002</td><td></td></tr><tr><td>tubo, bijoux Sterilin 7 mL poliestireno</td><td>Termo Científica</td><td>129A</td><td></td></tr><tr><td>tubo, cónico (Falcon) 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>tubo, cónico (Falcon) 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>tubo, microcentrífuga (Eppendorf) 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>tubo, microcentrífuga (Eppendorf) 2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.700</td><td></td></tr><tr><td>tubo, centrifugación S100 y nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355619</td><td></td></tr><tr><td>tubo, centrifugación S30 y nbsp;</td><td>Termo Científica</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Optima XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Rotor de ángulo fijo 70Ti</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada UltraPure DNasa/RNasa</td><td>Termo Científica</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>vórtice</td><td>VWR</td><td>444-2791</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Oxóide</td><td>LP0021T</td><td></td></tr></tbody></table>

refinamiento de onepot pure y producción de ribosomas crudos para la síntesis de proteínas libres de células reproducibles

Refinement of OnePot PURE and Crude Ribosome Production for Reproducible Cell-free Protein Synthesis

Refinamiento de OnePot PURE y producción de ribosomas crudos para la síntesis de proteínas libres de células reproducibles

Recent advances have enabled the Protein synthesis Using Recombinant Elements (PURE) cell-free system to be produced in individual laboratories ...

refinement-onepot-pure-crude-ribosome-production-for-reproducible

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