Estimulación de las células endoteliales vasculares mediante trampas extracelulares de neutrófilos en presencia de lipoproteínas de baja densidad

Las trampas extracelulares de neutrófilos están involucradas en una variedad de enfermedades, incluidas las enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, los efectos sinérgicos de la formación de NET y las lipoproteínas en las células vasculares siguen sin estar claros. Utilizando este protocolo, hasta la fecha se están realizando análisis mecanicistas de cómo se inducen las respuestas inflamatorias en las células endoteliales aórticas humanas tratadas con trampas extracelulares de neutrófilos y lipoproteínas de baja densidad.

Hemos demostrado que la lipoproteína de alta densidad actúa como supresor de la formación de NET. Eso es promovido por lipoproteínas oxidadas de baja densidad, fosfolípidos oxidados y lisofosfolípidos. Para comenzar, centrifugar de 45 a 50 mililitros de sangre entera humana obtenida en un tubo de heparina a 700 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

Reduzca lentamente la velocidad de la centrífuga después del centrifugado, luego recoja la capa superior que contiene la fracción de plasma. Centrifugar la fracción plasmática dos veces a 700 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar completamente las células sanguíneas, manteniendo el mismo ajuste de desaceleración. Luego agregue un microlitro de solución de EDTA de 250 milimolares por un mililitro de plasma para evitar la oxidación de lipoproteínas mediada por iones metálicos divalentes.

Coloque 2,7 mililitros de plasma en el tubo de ultracentrífuga. Superposición con 900 microlitros de PBS que contienen 250 EDTA micromolares. Luego ultracentrifugar el tubo a 600, 000 G durante siete minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, deseche 900 microlitros de la capa superior para eliminar la fracción de quilomicrones. Agregue 900 microlitros de PBS que contengan EDTA sobre el plasma restante y ultracentrífuga a 600, 000 G durante 2,5 horas a cuatro grados centígrados. Deseche 900 microlitros de la capa superior para eliminar la fracción de lipoproteínas de muy baja densidad.

Luego agregue 540 microlitros de 0,5 gramos por mililitro de solución de bromuro de potasio al plasma para ajustar la densidad a 1,063. Mezclar el contenido suavemente con una pipeta y ultracentrífuga a 600.000 G durante 2,5 horas a cuatro grados centígrados. Recolecte 540 microlitros de la capa superior que contiene lipoproteína de baja densidad.

Transfiera la fracción recolectada a una membrana de diálisis y dialícela contra dos litros de PBS que contengan EDTA a cuatro grados Celsius en la oscuridad para eliminar el bromuro de potasio. Agregue 152 microlitros de solución de polilisina al 0,01% o gelatina al 0,1% a cada pocillo de una placa de 12 pocillos e incube a temperatura ambiente durante al menos cinco minutos. Luego retire la solución de los pocillos, lave una vez con 200 microlitros de agua estéril y deje que los pozos se sequen completamente a temperatura ambiente.

Guarde el plato preparado a temperatura ambiente hasta su uso posterior. Prepare las placas recubiertas de gelatina siguiendo el mismo procedimiento que se demostró para la polilisina. Cultive dos veces diez a la potencia de seis células HL60 por 10 mililitros en medio RPMI-1640, suplementado con dos micromolares de ácido all-trans retinoico.

Después de cuatro días de incubación con ácido transretinoico todo, recolecte las células HL60. Centrifugar las células recogidas a 220 G durante cuatro minutos a 18 a 22 grados centígrados. Aspire el sobrenadante y luego lave las células con un volumen igual de medio RPMI-1640 sin suero.

Centrifugar las células lavadas nuevamente a 220 G durante cuatro minutos a 18 a 22 grados Celsius y volver a suspender las células en medio RPMI-1640 sin suero. Después de ajustar la concentración celular a dos veces diez a la potencia de seis celdas por mililitro, siembre 0,5 mililitros de la suspensión en cada pocillo de una placa de 12 pocillos prerecubierta con polilisina. Agregue 100 microlitros de medio RPMI-1640 sin suero con o sin 300 nanomolares forbol 12-miristato 13-acetato o PMA.

Cultive las células durante 30 minutos. A continuación, retire el medio de los pocillos. Lave las células una vez con medio RPMI-1640 sin suero y reemplácelo con RPMI-1640 sin suero que contenga cero o 20 microgramos por mililitro de lipoproteína de baja densidad.

Continúe cultivando las células durante dos horas. Recoja el medio de cultivo de cada pocillo en un tubo y centrifugue a 700 G durante tres minutos a 18 a 22 grados centígrados para eliminar los restos celulares. Para la estimulación, obtenga el cultivo de células endoteliales aórticas humanas y reemplace el medio gastado con 0,5 mililitros de medio de cultivo fresco, e incube las células durante 30 minutos.

Finalmente, agregue 167 microlitros del medio de cultivo recolectado de células similares a neutrófilos que contienen trampas extracelulares de neutrófilos y LDL a placas de células endoteliales aórticas humanas. La estimulación de las células endoteliales aórticas humanas con trampas extracelulares de neutrófilos condujo a cambios morfológicos dependientes de la dosis de una forma similar a un adoquín a una forma alargada. Los cambios morfológicos en las células endoteliales aórticas humanas mejoraron cuando se estimularon con trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por LDL, con un alargamiento visible aparente a partir de las seis horas.