Plataforma de imágenes sin lentes desplegable en campo para un análisis rápido sin etiquetas de la activación de células asesinas naturales

Nuestro objetivo es evaluar rápidamente la función inmunitaria cuantificando la activación de las células NK en tiempo real, utilizando imágenes sin etiquetas y sin lentes para mejorar la monitorización inmunitaria. Hemos demostrado que el índice de inmunidad innata, o I3, distingue de manera confiable entre la actividad de las células NK de donantes sanos e inmunocomprometidos y se correlaciona fuertemente con las citocinas y los marcadores de citometría de flujo. Los ensayos de células NK existentes requieren etiquetas, instrumentos voluminosos y largos tiempos de incubación.

Nuestra plataforma LSIT llena este vacío al permitir un perfilado rápido, asequible y sin etiquetas utilizando optoelectrónica simple. Nuestra plataforma LSIT sin etiquetas diferencia la activación de células NK a nivel de una sola célula en 30 segundos utilizando parámetros de sombra, eliminando la necesidad de tinción y la costosa citometría de flujo. Ampliaremos LSIT para monitorear la activación de células T y B e integrar algoritmos de aprendizaje profundo para la clasificación de alto rendimiento de diferentes estados de células inmunes.

Para comenzar, retire los kits para el aislamiento de células asesinas naturales, o NK, del refrigerador y déjelos alcanzar la temperatura ambiente, entre 15 y 28 grados centígrados. Prepare el equipo necesario colocando un separador magnético, pipetas con puntas estériles y ajuste una incubadora o bloque calefactor a 37 grados centígrados. Con una pipeta, agregue 0,5 mililitros de sangre completa al tubo de reacción con tapa verde que contiene el cóctel de anticuerpos.

Mezcle suavemente el contenido pipeteando hacia arriba y hacia abajo del tubo de cinco a seis veces. Luego, incube el tubo durante cinco minutos. Transfiera todo el contenido del tubo con tapa verde al tubo de separación con tapa roja con una pipeta y mezcle suavemente pipeteando el tubo de cinco a seis veces.

Coloque el tubo con tapa roja en el separador magnético e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Mientras mantiene el imán en su lugar, use una pipeta para transferir aproximadamente 1,5 mililitros del sobrenadante al tubo de separación dos con tapa púrpura. Mezcle suavemente el contenido pipeteando el tubo de cinco a seis veces.

Ahora, coloque el tubo con tapa púrpura en el separador magnético e incube durante 10 minutos. Mientras el imán aún está en su lugar, transfiera aproximadamente 1 mililitro del sobrenadante a un tubo de recuperación con tapa gris con una pipeta y mezcle cuidadosamente el contenido pipeteando el tubo. A continuación, agregue 100 microlitros de la suspensión aislada de células asesinas naturales en el tubo del vehículo y otros 100 microlitros en el tubo del cóctel estimulador de activación, o ASC.

Mezcle suavemente el contenido de ambos tubos con un mezclador de vórtice para garantizar una distribución uniforme. Incube los tubos en el bloque calefactor o en la incubadora a 37 grados centígrados durante una hora. Encienda la plataforma LSIT.

Inicie el software de captura LSIT. Inicie sesión ingresando su ID y contraseña, luego seleccione Calibrar para iniciar el modo de calibración. Presione el botón Abrir en la pantalla táctil o use el botón físico de la puerta corredera para abrir el cajón.

Cuando se abra el cajón, retire la corredera de calibración y guárdela. Ahora, haga clic en Establecer fondo para calibrar la intensidad óptica. Vuelva a colocar la corredera de calibración en el cajón y ciérrelo.

A continuación, haga clic en Iniciar calibración para completar el proceso. Retire un portaobjetos de ensayo de su bolsa. Etiquételo con los datos de la muestra antes de colocarlo sobre una superficie limpia y plana.

Pipetee 10 microlitros de la muestra del vehículo en los canales A y B, y luego pipetee 10 microlitros de la muestra estimulada por ASC en los canales C y D. Ahora, presione Abrir para expulsar el cajón. Retire la corredera de calibración y colóquela en una caja de almacenamiento. Inserte la diapositiva de ensayo preparada en el cajón y presione Cerrar para asegurarla.

Vuelve al menú principal y selecciona la Actividad y Prueba de Células NK en la pantalla principal. Introduzca el ID de la muestra o escanee el código de barras para cargar el perfil de la muestra. Luego, presione Capturar para comenzar la grabación de imágenes.

Después de capturar la imagen, haga clic en Analizar para comenzar a procesar. Revise el porcentaje de actividad de las células NK y el recuento de células que se muestran en la pantalla. Descargue los resultados en una unidad USB o imprímalos usando el menú de la pantalla táctil.

Seleccione Recuento y prueba de celdas en la interfaz principal de LSIT. Cargue 10 microlitros de la nueva muestra en un canal de portaobjetos de ensayo nuevo con una pipeta. Inserte la corredera en el cajón.

Cierre el cajón con la pantalla táctil o el botón e introduzca el ID de la muestra en el sistema. Introduzca el factor de dilución en la pantalla táctil, si procede, y pulse Recuento para iniciar la cuantificación de celdas. Vea los resultados que se muestran como células por microlitro en la pantalla.

Después del análisis, abra el cajón presionando el botón Abrir o alternando el interruptor físico. Retire la corredera usada del cajón con las manos enguantadas. Finalmente, vuelva a colocar la corredera de calibración en el cajón para proteger el sensor y ciérrelo con la pantalla táctil o el interruptor de palanca físico.

La plataforma LSIT con software integrado evaluó cuantitativamente la activación de las células NK comparando los valores de CSP de las células de control activadas y no estimuladas. Proporcionó al informe de inmunidad un cuadro estadístico resumido. La estimulación de ASC indujo cambios morfológicos claros en las células NK, incluido el aumento del tamaño y la complejidad citoplasmática, como se observa en las citocentrifugas teñidas con Hema 3 después de 30 minutos y dos horas.

Las imágenes de sombra mostraron que las células estimuladas por ASC tenían patrones de difracción visiblemente más complejos en comparación con los controles de vehículos, con parámetros extraídos que indicaban una mayor distancia de pico a pico, granularidad citoplasmática y parámetro de sombra combinado. Los valores combinados de los parámetros de sombra permitieron una clasificación clara entre donantes sanos y pacientes con cáncer, con una superposición mínima en las distribuciones de células individuales de células NK activadas y no activadas. Los donantes sanos mostraron valores de índice de inmunidad innata significativamente más altos que los pacientes con cáncer después de la estimulación de ASC.