Name: Detección in situ de ADN de parásitos tripanosomátidos y Nosema ceranae mediante lisis alcalina acoplada al sistema RPA/CRISPR/Cas12a (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprenda a detectar patógenos de abejas mediante RPA y CRISPR/Cas12a con lisis alcalina. Este método isotérmico ofrece mayor sensibilidad que QPCR para identificar Lotmaria passim y Nosema ceranae en campo.

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<ol><li>Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bee+declines+driven+by+combined+stress+from+parasites%2C+pesticides%2C+and+lack+of+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers.</a> Science. 347 (6229), 1255957(2015).</li>
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<li>Hao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+lyophilized+CRISPR%2FCas12a+and+RPA+assay+for+rapid+detection+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem+J%22%5BJournal%5D)">Application of a lyophilized CRISPR/Cas12a and RPA assay for rapid detection of Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Microchem J. 206, 111443(2024).</li>
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</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6641">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68871">10.3791/68874</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68874">On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

<table><tbody><tr><td>0,2 ml de tubos Eppendorf sin DNAsa y RNAsa</td><td>Axygen</td><td>MTC-02-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf libres de 1,5 ml de ADNasa y ARNasa</td><td>Axygen</td><td>MTC-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L puntas filtradas de baja retención</td><td>Clínicas de laboratorio</td><td>5-063-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L puntas filtradas de baja retención</td><td>Clínicas de laboratorio</td><td>5-120-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L puntas filtradas de baja retención</td><td>Clínicas de laboratorio</td><td>5-203-P4-0</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de bloque seco Stuart serie BH-200</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-36610-00</td><td></td></tr><tr><td>Agua tratada con DEPC</td><td>Ambicon</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>EnGen Lba Cas12a (Cpf1)</td><td>Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Morteros de microtubos</td><td>Marca de pescador</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>Milenia GenLine HybriDetect</td><td>Milenia</td><td>MGHD 1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>RPA kit TwistAmp Liquid Basic</td><td>Amplificador giratorio</td><td>&nbsp; TALQBAS01</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí</td><td>Swann-Morton</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta única Chanel PIPETMAN P1000L Micropipeta Expulsión de metal</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta única Chanel PIPETMAN P100L Micropipeta Expulsión de metal</td><td>Gilson</td><td>F144057M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta única Chanel PIPETMAN P10L Micropipeta Expulsión de metal</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito de sodio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de detección de PCR táctil en tiempo real</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp Líquido Básico</td><td>Torcer</td><td>TALQBAS01</td><td></td></tr></tbody></table>

detección in situ de adn de parásitos tripanosomátidos y nosema ceranae mediante lisis alcalina acoplada al sistema rpa/crispr/cas12a

On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

Aquí hemos descrito un método rápido in situ que utiliza la lisis alcalina del abdomen de las abejas obreras junto con la amplificación de RPA y la detección basada en CRISPR/Cas12a mediante enfoques de fluorescencia y/o flujo lateral. El esquema del flujo de trabajo completo se representa en la Figura 3, y el esquema de la lisis alcalina HotSHOT del abdomen de las abejas obreras se encuentra en la Figura 4. Los resultados representativos del ensayo RPA/CRISPR/Cas12a se muestran en la Figura 5. Para detectar L. passim y N. ceranae, se utilizó un termociclador para cuantificar las unidades de fluorescencia relativa (RFU) utilizando una sonda marcada con FAM (Figura 4A). Las reacciones de RPA se realizaron utilizando 10 ng de ADN, y los datos de fluorescencia se trazaron en un gráfico (Figura 4B). En la etapa final del ensayo, las muestras en tubos cónicos se fotografiaron utilizando un sistema de imágenes en gel (Figura 4C). Para la detección con una sonda marcada con biotina, las muestras se incubaron en un termobloque (Figura 4A); la solución de detección se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se aplicó en una tira de flujo lateral (Figura 4B, C). El método dio como resultado una detección exitosa de ambos patógenos de las abejas melíferas.
Para determinar la eficiencia de las reacciones de RPA, comparamos este método con la qPCR estándar utilizando ADN purificado de abejas melíferas utilizando el kit de referencia (ver la Tabla de Materiales). Un total de 32 muestras de abejas fueron analizadas con cebadores dirigidos al gen β-tubulina de L. passim para ambos métodos y luego se detectaron mediante trans-escisión CRISPR/Cas12a de sondas fluorescentes. Cabe destacar que, como resultado, 12 muestras resultaron positivas por qPCR, mientras que RPA/CRISPR/Cas12a detectó L. passim en 16 muestras (Figura 5A). Esto indica que el rendimiento de la reacción RPA es más sensible que el de la PCR, como método de amplificación de ADN de referencia.
Asimismo, determinamos el límite de detección (LOD) para qPCR y RPA acoplado a la detección CRISPR/Cas12a para el ADN de L. passim como modelo de patógeno utilizando diluciones seriadas de ADN de L. passim que oscilaron entre 66 ng y 6 fg. La qPCR detectó tan solo 6 pg, lo que corresponde a aproximadamente 96 parásitos (Figura 5B). En comparación, el LOD para RPA correspondió a 96 parásitos (Figura 5C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig1.jpg"> 
Figura 1: Flujo de trabajo general de la lisis alcalina HotSHOT junto con la amplificación de RPA y los métodos de detección de Cas12 en abejas melíferas. Abreviaturas: RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; Cas = proteína asociada a CRISPR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig2.jpg"> 
Figura 2: Procesamiento de la lisis celular lista para la amplificación con tampón HotSHOT. (A) Cortar el abdomen de la abeja con un bisturí y ponerlo en un tubo de centrífuga; (B) con un mortero, hacer una maceración con 400 μL de HotShot; (C) incubar en un termobloque a 95 °C durante 10 min; y (D) neutralizar con 400 μL de Tris-HCl de 40 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig3.jpg"> 
Figura 3: Flujo de trabajo general para la preparación de la enzima Cas12a y soluciones de sonda reportera marcadas con FAM y biotina. Abreviaturas: DEPC-agua = agua tratada con pirocarbonato de dietilo; crRNA= ARN CRISPR; Cas12 = tipo de proteína asociada a CRISPR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig4.jpg"> 
Figura 4: Detección de Lotmaria passim y Nosema ceranae por el método CRISPR/Cas12a con sondas FAM y biotina. Para la detección de FAM, (A) las muestras se incuban en un termociclador; (B) las unidades de fluorescencia relativa (RFU) de L. passim y N. ceranae; (C) visualización de las mismas muestras bajo un sistema de fotodocumentación. En los ensayos de biotina, a) una muestra incubada en un bloque térmico; (b) las muestras se añadieron en una inmunotira del kit (véase la Tabla de Materiales); c) los resultados después de la incubación. Abreviaturas: LP= Lotmaria passim; NC= Nosema ceranae; NTC= sin control de plantilla; RFU: unidades de fluorescencia relativa <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig5.jpg"> 
Figura 5: Comparación entre qPCR y RPA, y límite de detección de Lotmaria passim. (A) Detección de L. passim en muestras de abejas melíferas utilizando qPCR convencional y RPA. (B) Límite de detección de qPCR de L. passim utilizando SsoFast EvaGreen. (C) Límite de detección de L. passim usando CRISPR/Cas12a con una sonda marcada con FAM; (D) visualización de la misma detección de CRISPR/Cas12a (desde C) bajo un sistema de imágenes en gel (fila superior), y los resultados de flujo lateral correspondientes utilizando CRISPR/Cas12a con una sonda marcada con biotina (fila inferior). Abreviaturas: RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; qPCR= reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reactivo</td>
			<td>Concentración final</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Tampón de reacción</td>
			<td>1 vez</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>1,8 mM</td>
			<td>1,8 μL</td>
			<td>9 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x E-Mix Básico</td>
			<td>1 vez</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cebador delantero (10 μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imprimación inversa (10 μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Mezcla de reacción central</td>
			<td>1 vez</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Agua</td>
			<td>--</td>
			<td>0,7 μL</td>
			<td>3,7 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Componentes de la mezcla maestra para RPA con volúmenes finales de 10 μL y 50 μL, y las concentraciones de trabajo correspondientes:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reactivo</td>
			<td>Concentración final</td>
			<td>Reacción de 10 μL</td>
			<td>Reacción de 50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>280 mM MgOAc</td>
			<td>1,8 mM</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADN</td>
			<td>10-0,1 ng</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Volumen de reactivos a añadir por muestra en una reacción de RPA
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reactivo</td>
			<td>[existencias]</td>
			<td>[final]</td>
			<td>1x (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzima Cas12a</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARNc</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonda FAM</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Búfer NEB 10x</td>
			<td>10 veces</td>
			<td>1 vez</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicón de RPA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>32.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 3: Concentraciones de reactivos para hacer una mezcla de detección de FAM por el método CRISPR/Cas 12a. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reactivo</td>
			<td>[existencias]</td>
			<td>[final]</td>
			<td>1x (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzima Cas12a</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARNc</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonda de biotina</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>500 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Búfer NEB 10x</td>
			<td>10 veces</td>
			<td>1X</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicón de RPA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 4: Concentraciones de reactivos para hacer una mezcla de detección de biotina por el método CRISPR/Cas 12a.

Detección in situ de ADN de parásitos tripanosomátidos y Nosema ceranae mediante lisis alcalina acoplada al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

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Detección in situ de ADN de parásitos tripanosomátidos y Nosema ceranae mediante lisis alcalina acoplada al sistema RPA/CRISPR/Cas12a (Video) | JoVE Journal

Detección in situ de ADN de parásitos tripanosomátidos y Nosema ceranae mediante lisis alcalina acoplada al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

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