Evaluación del efecto de los factores SASP en la proliferación de células cancerosas mediante un análisis comparativo de tres metodologías distintas

Las células cancerosas senescentes secretan estos factores que influyen en las células vecinas. Presentamos tres modelos in vitro para estudiar los efectos paracrinos y yuxtacrinos impulsados por SASP sobre la proliferación celular HeLa, monitorización de impedancia en tiempo real y análisis dinámicos, cinéticos y morfológicos habilitados por imagen de células vivas, revelando efectos paracrinos senescentes y microambientales más allá de los ensayos finales tradicionales. Para empezar, enciende el sistema de análisis de celdas en tiempo real antes de la siembra de celdas.

Lanzar la versión 2.0 del software RTCA. Haz clic en el botón de X notas e introduce los detalles experimentales. Haz clic en el botón Horario y añade dos pasos para registrar antecedentes y monitorizar la proliferación celular cada 15 minutos durante 72 horas.

Elige el primer paso y haz clic en Jugar. Añadir manualmente 50 microlitros de medio completo a cada pozo de la vista de la placa electrónica. A continuación, lava tanto las células HeLa seniscentes como las no senescentes con cinco mililitros de PBS estéril precalentado.

Después de aspirar, añade un mililitro de tripsina precalentada al 0,05% e incuba. Neutraliza la tripsina con cinco mililitros de DMEM completo suplementado con antibióticos. Luego, centrifuga las pilas a 500 G a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Tras descartar el sobrenadante, vuelve a suspender los globos celulares en cinco mililitros de DMEM completo suplementado con antibióticos. Ahora, siembra células HeLa no senescentes en cada pozo de una vista de placa electrónica en 100 microlitros de DMEM completo suplementado con antibióticos. Coloque la vista de la placa electrónica en la cuna del sistema de análisis celular en tiempo real para permitir que las células se adhieran a la superficie de la placa en la incubadora.

Elige el segundo paso y haz clic en reproducir para iniciar la medición de impedancias. Las células semilla en la placa electrónica insertan pozos que contienen 60 microlitros de DMEM completo suplementado con antibióticos bajo tres configuraciones experimentales diferentes. Mantenga el inserto de la placa electrónica a 37 grados Celsius en una incubadora con 5% de dióxido de carbono durante seis horas para su fijación.

Haz clic en pausa tras seis horas de siembra celular, luego aspira suavemente el medio de cultivo de cada pozo de la vista de la placa electrónica para eliminar las células séricas y no adherentes. Lava pozos dos veces con PBS precalentado a 37 grados Celsius. Añade 140 microlitros de DMEM sin suero a cada pozo de la vista de la placa electrónica.

Quita el medio. Lava los pozos del inserto de placa electrónica con PBS, luego añade 60 microlitros de DMEM sin suero. Ahora, coloca el inserto de la placa de la e-plate en la vista de la placa de la e.

Presiona suavemente hasta que el inserto esté completamente sembrado en el pozo. Inserta la placa combinada en el sistema de análisis de celdas en tiempo real. Haz clic en Play para reanudar el monitoreo en tiempo real de los valores del índice celular cada 15 minutos usando el software.

Normaliza los valores del índice de celdas en el momento en que la vista de la placa electrónica y la inserción de la placa E se combinan e insertan en el sistema de análisis de celdas en tiempo real. A continuación, pulsa el botón de Análisis de Datos para calcular la tasa y cantidad de proliferación utilizando los datos máximos de índice y pendiente de celda obtenidos del sistema de análisis celular en tiempo real. Luego, analiza los datos utilizando un programa estadístico adecuado.

Aspirar el medio de cultivo de ambas placas de seis pozos que contienen las células HeLa seniscentes y no senescentes. Lava las células dos veces con PBS precalentado a 37 grados Celsius para eliminar residuos de suero y células residuales. Añade dos mililitros de medio DMEM sin suero y suplementado con antibióticos en cada pozo, y luego incuba las células en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.

Recoge el material acondicionado de cada pozo en tubos estériles en un gabinete de seguridad laminar. Centrifugar el medio acondicionado recogido a 1000 g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar los restos de la celda, seguido de centrifugación a 10.000 g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para obtener el sobrenadante clarificado. Luego, centrifugar el medio acondicionado utilizando unidades de filtro ultracentrífugo de dos mililitros a cuatro grados Celsius durante 60 minutos a 3000 g para concentrarlo a 400 microlitros.

Diluir el concentrado obtenido con un medio fresco sin suero para preparar medios acondicionados concentrados 1x, 2x y 3x en tubos estériles en una cabina de seguridad laminar. Cuando las células se hayan adherido, aspira suavemente el medio de cultivo de cada pozo de la vista de la placa electrónica para eliminar las células séricas y no adherentes y lavar con PBS. A continuación, una pipeta de 200 microlitros precalentó medios condicionados recogidos a 37 grados Celsius en cada grupo.

Inserta la vista de la placa electrónica en el sistema de análisis de celdas en tiempo real y haz clic en reproducir para reanudar el monitoreo en tiempo real de los valores del índice celular cada 15 minutos durante 48 horas. Colocar las células semilla en una microlamina bajo tres montajes experimentales e incubar a 37 grados Celsius en una atmósfera humidificada con un 5% de dióxido de carbono. Tras ocho horas de inserción, lava las células dos veces con PBS precalentado a 37 grados Celsius.

Añade 200 microlitros de Dulbecco's Modified Eagle's Medium sin suero a cada pozo. Enciende el controlador de temperatura 2002-2 y ponlo a 37 grados Celsius. Enciende el CO2-Controller 2000 y ponlo al 5% de dióxido de carbono.

Enciende la fuente de luz de fluorescencia. Coloca el portaobjetos en la cámara de incubación de la parte superior del escenario. Inicia el software en el ordenador.

Selecciona el objetivo de 20x. Añade el canal de contraste de fase y el canal FITC de fluorescencia. Usando el controlador de escenario, marca las posiciones de cada ubicación.

Establece el intervalo de tiempo a 30 minutos y la duración de la adquisición a 48 horas, y luego comienza la adquisición. Cuenta las células positivas a proteínas fluorescentes verdes en ambos puntos temporales y calcula el aumento porcentual para el análisis. El tratamiento con doxorrubicina indujo significativamente la senescencia celular en las células HeLa.

La cuantificación de células SA-beta-gal-positivas mostró un porcentaje significativamente mayor en el grupo tratado con doxorubicina en comparación con el grupo control. En el primer enfoque, las células HeLa no senescentes co-cultivadas con células Senescentes de HeLa mostraron una tasa y capacidad de proliferación significativamente mayores en comparación con las células co-cultivadas con células HeLa no senescentes. Los medios condicionados derivados de células HeLa senescentes en concentraciones 2x y 3x aumentaron significativamente la tasa y capacidad de proliferación de células HeLa no senescentes en comparación con medios acondicionados de células no senescentes.

En el tercer enfoque, tras 48 horas de cocultivo, las células HeLa positivas para GFP mostraron un aumento significativamente mayor en la proliferación cuando se co-cultivaron con células HeLa senescentes en comparación con cocultivos no senescentes o controles solo con GFP.