Revelando el control electromecánico de la homeostasis tisular mediante un dispositivo microfluídico de dos capas

Aplicamos campos eléctricos controlados para estudiar cómo responden los tejidos a las señales eléctricas, centrándonos en cómo las corrientes o campos regulan la adhesión, proliferación y extrusión celular, afectando la homeostasis de los tejidos. Descubrimos que la dirección de las corrientes fisiológicamente relevantes dicta los estados de los tejidos. El campo apical a basal indujo un fenotipo proliferativo, mientras que el campo basal a apical promueve la extrusión celular, lo que permite la modulación de la densidad celular general.

Si bien los estudios bioeléctricos cuantitativos se han centrado durante mucho tiempo en la migración a través de la gravitaxia, la homeostasis tisular sigue siendo inaccesible. Nuestro sistema ahora permite la investigación directa de cómo los envases fisiológicos regulan la organización y el mantenimiento de los tejidos. Nuestro protocolo integra microfluídica, estimulación eléctrica de tejidos, microscopía de estructura y fuerza, e imágenes en vivo para estudiar el control electromecánico de la homeostasis tisular.

Nuestro trabajo reveló reglas básicas de acoplamiento electromecánico. Con nuevas herramientas, ahora podemos explorar cómo emergen los patrones bioeléctricos nativos y regulan los tejidos y si podemos controlar el comportamiento de los tejidos complejos ajustando estas señales electromecánicas. Para comenzar, coloque una capa limpia de un molde de polidimetilsiloxano, o PDMS, boca arriba sobre una tapa de plato de plástico limpia y agregue 500 microlitros de adhesivo líquido curable por ultravioleta lentamente sobre el molde.

Con una espátula, humedezca con cuidado todas las estructuras que sobresalen y elimine las burbujas de aire formadas durante el proceso de humectación. Presione suavemente un cubreobjetos sobre el molde PDMS y utilice un limpiador de laboratorio para eliminar cualquier exceso de adhesivo curable por ultravioleta, asegurándose de que la parte superior del cubreobjetos permanezca limpia y plana. Cure la estructura parcialmente bajo luz ultravioleta iluminada uniformemente con una longitud de onda entre 363 y 370 nanómetros.

Limpie cualquier marca con etanol al 75%. Luego, sostenga la estructura firmemente sobre una superficie plana y retire lentamente el molde PDMS de la capa curada. Luego, coloque una capa limpia de dos moldes PDMS boca abajo sobre una losa PDMS plana que tenga más de 2,5 milímetros de grosor.

Golpee suavemente las características del molde desde arriba con unas pinzas. Observe la interfaz debajo de las características para oscurecer o contrastar ópticamente, lo que confirma el contacto adecuado. Ahora, rellene el espacio entre el molde PDMS y la losa con adhesivo líquido curable por ultravioleta por capilaridad.

Cure parcialmente la estructura bajo luz ultravioleta durante 10 segundos, como se demostró anteriormente. Use pinzas acolchadas suaves para despegar suavemente la capa adhesiva compuesta curable por rayos ultravioleta y el molde PDMS de la losa PDMS. Si es necesario, recorte los bordes sobrantes de la capa adhesiva curada con unas tijeras afiladas.

A continuación, coloque la capa uno unida a una cubierta de vidrio rectangular sobre una superficie plana. Alinee la capa dos, aún unida a su molde PDMS, con la capa uno y presione ambas capas juntas firmemente hasta que aparezcan sombras debajo de las características. Cure la estructura alineada bajo luz ultravioleta durante 10 segundos para unir las capas uno y dos en un chip microfluídico de dos capas, luego retire suavemente el molde PDMS del chip adherido.

Pipetee inmediatamente 10 microlitros de solución precursora de gel de poliacrilamida en el centro de la región del tejido directamente sobre la hendidura en la capa dos. Presione suavemente un cubreobjetos de vidrio redondo, de 10 milímetros de diámetro, sobre la gota para formar un gel plano. Observe cómo la solución de gel fluye hacia la capa uno a través de la hendidura y deténgase en la fila de pilares de barrera.

Cure inmediatamente el chip microfluídico ensamblado bajo luz ultravioleta durante cinco minutos. Luego, deje el chip intacto durante aproximadamente una hora para permitir que el gel de poliacrilamida se solidifique por completo. A continuación, incube el chip microfluídico en tampón HEPES molar 0,1 a pH 7,4 durante al menos una hora para hidratar el gel y reducir la adhesión entre el gel y el cubreobjetos.

Luego, use suavemente pinzas afiladas para quitar el cubreobjetos de la superficie del gel. Coloque un cartucho de policarbonato de grado médico sobre una superficie plana con la parte inferior hacia arriba y alinee una viruta seca hacia abajo con el cartucho. Pipetee el adhesivo curable UV en las grietas entre el chip y el cartucho, llenándolas mediante efecto capilar, y cúrelo con luz ultravioleta.

Esterilice los dispositivos microfluídicos fabricados colocándolos bajo luz ultravioleta a 200 a 280 nanómetros dentro de un gabinete de bioseguridad. Prepare el volumen requerido de 50 microgramos por mililitro de colágeno en una solución de trabajo en 1X DPBS en hielo. En hielo, prepare la solución de trabajo de Sulfo-SANPAH diluyendo dos microlitros de solución madre de Sulfo-SANPAH, previamente disuelta en dimetilsulfóxido anhidro en 80 microlitros de tampón HEPES molar frío de 0,1 a pH 7,4 almacenado a cuatro grados centígrados.

Frote los bordes del gel de poliacrilamida con toallitas de laboratorio para secarlo dentro del dispositivo. Pipetear 80 microlitros de solución de trabajo Sulfo-SANPAH sobre la superficie del gel, asegurando una inmersión total, y colocar el chip bajo luz ultravioleta durante cinco minutos para activar el Sulfo-SANPAH. Enjuague el gel tres veces con tampón HEPES molar 0,1 frío a pH 7,4.

Repita el tratamiento con Sulfo-SANPAH pipeteando 80 microlitros de solución de trabajo SS sobre el gel e irradiándolo bajo luz ultravioleta durante cinco minutos. Esta vez, enjuague el gel tres veces con 1X DPBS frío. Finalmente, pipetee 100 microlitros de una solución de colágeno en el gel de poliacrilamida, asegurando una cobertura completa, y déjelo durante una hora.

Enjuague el colágeno no adherido con 1X DPBS tres veces, luego mantenga el gel sumergido en 1X DPBS hasta su uso posterior. Fije los dispositivos a los insertos con tornillos. Luego, asegure hasta cuatro conjuntos de insertos de dispositivos al soporte diseñado para montarse en una platina de microscopio.

Agregue dos mililitros de medio de cultivo a cada pocillo principal de los dispositivos y a través de los canales de eliminación de desechos para enjuagar y reemplazar el DPBS 1X. Luego, inserte los electrodos de platino en el tubo que contiene 45 mililitros de medio, asegurándose de que estén completamente sumergidos en el medio. Tire del medio de cultivo a través del tubo Tygon con una jeringa y sujételo bien.

Conecte un extremo del tubo de llenado medio a la cámara del electrodo y el otro extremo al dispositivo. Ahora, prepare una suspensión celular siguiendo las recomendaciones de tripsinización o preparación de suspensión celular y siembre 0,1 millones de células en el pozo principal. Monte la configuración en el microscopio con las cámaras de electrodos a los lados y conecte el medidor fuente a la cámara de electrodos.

Utilice tres dispositivos con resistencia de canal idéntica. Asigne uno como grupo de control. Aplique la corriente apical a la basal al segundo dispositivo y la corriente basal a la apical al tercer dispositivo.

Fuente una señal eléctrica en modo de pinza de corriente y suministra una corriente total de 20 microamperios. Elija una lente de objetivo de 20X para obtener imágenes de tejido completo con un microscopio de epifluorescencia. Finalmente, elija el canal 561 para los canales de fluorescencia roja y campo claro.

Seleccione un intervalo de tiempo de una hora durante las imágenes de larga duración. Se aplicó estimulación eléctrica perpendicular a las células para interrumpir el potencial transepitelial y estudiar su papel en el comportamiento tisular bajo diferentes direcciones de corriente. Bajo imágenes de contraste de fase, las corrientes apicales a basales o ATB hicieron que las uniones celulares se iluminaran dentro de los 10 minutos posteriores a la aplicación, mientras que las condiciones de control y basales a apicales, BTA, mostraron superficies apicales planas y de bajo contraste.

Las corrientes ATB produjeron una convexidad hacia afuera en la superficie de la célula apical. La deformación del gel dependía en gran medida de la dirección de la corriente. Las corrientes ATB tiraron del gel hacia arriba, mientras que las corrientes BTA comprimieron el gel hacia abajo.

La intensidad de la E-cadherina de unión aumentó bajo las corrientes BTA, pero disminuyó significativamente bajo las corrientes ATB en comparación con el control. La intensidad de la actina de unión disminuyó bajo las corrientes ATB, pero no aumentó significativamente bajo las corrientes BTA en relación con el control. Las corrientes de ATB desencadenaron extrusiones de células vivas multicelulares a través de la monocapa, mientras que las corrientes de BTA conservaron la estructura de la monocapa, similar a la del control.

La heterogeneidad espacial en la distribución celular fue significativamente mayor bajo las corrientes de ATB, pero se mantuvo baja y uniforme bajo BTA y condiciones de control. Las tasas de proliferación celular aumentaron bajo la estimulación de ATB, con tasas de división más altas con el tiempo. Por el contrario, las corrientes de BTA indujeron más eventos de muerte celular.