Disección de tejidos craneofaciales de pez cebra al teñirlos con azul alcián

Estamos explorando los mecanismos por los cuales el paladar del pez cebra crece con el tiempo utilizando muestras fijas, así como imágenes de lapso de tiempo de embriones con alta resolución espacio-temporal utilizando microscopía de hoja de luz. Nuestro protocolo es simple y fácil de seguir. Establece pasos detallados para diseccionar y separar los cartílagos craneofaciales de una larva de pez cebra de cinco días.

Este protocolo ha permitido una caracterización cuidadosa de la forma del paladar a escala tisular y celular, lo que en última instancia nos permite evaluar el efecto de los antígenos de comentario en la morfogénesis del paladar. Para comenzar, obtenga de 20 a 25 larvas de pez cebra anestesiadas y retire el anestésico una vez que las larvas hayan dejado de moverse. Agregue 1,5 mililitros de aldehído paraformo al 4% al tubo y coloque la muestra en un balancín a 60 revoluciones por minuto a temperatura ambiente durante dos horas.

Con una pipeta, retire la mayor cantidad posible de fijador del tubo. Luego agregue 1,5 mililitros de etanol al 50% a la muestra y colóquela en un balancín a temperatura ambiente a 60 revoluciones por minuto durante 10 minutos. Ahora, con una pipeta, aspire el etanol del tubo y agregue 1,5 mililitros de solución de tinción azul alcián a la muestra.

Incube las larvas en la solución de tinción durante 18 a 20 horas a temperatura ambiente mientras se balancea a 60 revoluciones por minuto. A continuación, retire la solución de manchas con una pipeta y lave las larvas con 1,5 mililitros de agua destilada durante uno o dos minutos en un balancín a temperatura ambiente. Luego agregue un mililitro de solución de lejía a la muestra e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos sin cubrir los tubos.

Con una pipeta, retire la solución de lejía de la muestra y trate la muestra con las soluciones de limpieza de tejidos uno y dos. Después de retirar la solución dos, agregue de 1,5 a dos mililitros de solución de almacenamiento a la muestra. Debido al contenido de glicerol, observe cómo las muestras teñidas se hunden gradualmente hasta el fondo en 10 minutos.

Coloque una larva teñida en su lado lateral en la placa de Petri recubierta de agarosa. Con fórceps, raspe suavemente la yema del cuerpo de las larvas. Después de la eliminación de la yema, transfiera las larvas a una placa de Petri fresca para evitar interferencias durante la disección, sostenga las larvas cerca de la parte posterior de la cabeza con un par de fórceps.

Con otro par, retire con cuidado los ojos sin dañar las estructuras craneales faciales circundantes. Mientras sostiene la larva, todavía con un par de fórceps, haga una incisión en el centro del tejido dorsal al neurocráneo. Luego pellizque y arranque el cerebro y los tejidos asociados.

A continuación, separe la cabeza de las larvas del resto del cuerpo. La región de la cabeza resultante debe incluir el cráneo neurológico y el cráneo visceral aún adherido en los extremos anterior y posterior. Corta con cuidado los dos puntos de conexión entre el cráneo neuro y el cráneo visceral con fórceps para separarlos por completo.

Finalmente, coloque una o dos gotas de glicerol al 100% en un portaobjetos de vidrio limpio y transfiera el cráneo neuro o el cráneo visceral disecados al portaobjetos. Con fórceps, coloque suavemente un cubreobjetos encima de los pañuelos asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas, y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas antes de la toma de imágenes. El cráneo neuro diseccionado mostró múltiples estructuras claramente etiquetadas, incluida la placa etmoidal, la trabécula y el cartílago pericárdico, lo que permite un análisis estructural detallado.

El cráneo visceral incluía el cartílago de Meckel y elementos adicionales como el cuadrado palato y los cartílagos basilbranquiales. La tinción con azul alcián a los cinco días después de la fertilización permitió una visualización clara de la placa etmoidal. El ancho y el largo de la placa etmoidal se pudieron medir consistentemente mediante el análisis de imágenes, y la longitud fue significativamente mayor que el ancho, y cuantificó los datos de 15 muestras.

El área de la placa etmoidal se extrajo de los datos de la imagen y se confirmó mediante cuantificación con marcas de límite claras. Se observaron distintas disposiciones celulares en la placa etmoidal con células cuboides en la región medial y células columer en las partes laterales. La tinción Dappy permitió la visualización de núcleos celulares individuales dentro de la placa etmoidal.