Mutagénesis basada en CRISPR-Cas9 en el nematodo entomopatógeno Steinernema hermaphroditum y el mantenimiento de líneas mutantes
30 de diciembre de 2025
Este artículo demuestra la ingeniería genómica mediada por CRISPR-Cas9 en Steinernema hermaphroditum, un nematodo entomopatógeno (EPN: insectoparasito) y un modelo genético emergente. La tecnología descrita es útil para crear mutantes, permitiendo la elucidación de funciones génicas en la biología de los nematodos relevantes para la simbiosis mutualista y parasitaria.
Estamos trabajando en la genética de la simbiosis bacteriana nematodo, que tiene aplicaciones agrícolas. Las herramientas genéticas en la bacteria Xenorhabdus están muy bien desarrolladas, pero la genética de la EPN sigue siendo limitada, basándose principalmente en pruebas de ARN y EMS. Para empezar, obtén placas de agar de nematodo sembradas con Xenorhabdus griffiniae y Comamonas aquaticus.
Selecciona nematodos Steinernema hermaphroditum sobre las placas NGM preparadas que contienen Xenorhabdus griffiniae. Incubalos a 25 a 28 grados Celsius para un crecimiento óptimo. La noche antes de la microinyección, selecciona hermafroditas de la etapa J3 sobre placas de agar NGM frescas sembradas con Xenorhabdus griffiniae.
El día de la microinyección, elige hermafroditas jóvenes adultos para la inyección. Extrae la secuencia génica objetivo del genoma de referencia de Steinernema hermafrodito usando BlastP. Selecciona un exón codificante temprano, preferiblemente el primero, e introduce la secuencia en CRISPRscan usando los ajustes por defecto para generar ARN CRISPR candidatos.
Bombardea los principales ARN candidatos CRISPR contra el genoma de Steinernema hermafrodito para asegurarte de que no haya coincidencias fuera del objetivo. Almacena los ARN CRISPR seleccionados y los ARN CRISPR transactivadores universales a 100 micromolares cada uno en un buffer dúplex a menos 80 grados Celsius. Funde 2% de agarosa en agua usando un microondas.
Transfiere 50 microlitros de la agarosa fundida a un vaso cubierto. Cúbrelo inmediatamente con un segundo vaso de tapa. Tras un tiempo de secado de 20 minutos, quita el cristal superior de la tapa y luego etiqueta la parte frontal de la almohadilla de agarosa.
Guarda las almohadillas de agarosa a temperatura ambiente para un uso prolongado durante meses o años. Para preparar las agujas para la inyección, extrae capilares de cuarzo de un extractor de filamento láser y guarda las agujas en una caja de almacenamiento de pipetas. Prepara dúplexes de ARN guía frescos mezclando los crRNAs seleccionados y ARN CRISPR transactivadores universales en una proporción uno a uno.
Incuba el tubo a 94 grados Celsius durante dos minutos, luego enfría hasta temperatura ambiente para recocer dúplex. Monta la mezcla de inyección combinando Cas9, cloruro de potasio y los dúplex de gRNA e incuba. Haz tres golpes en el tubo de PCR para mezclarlo y luego haz girar brevemente durante 10 a 15 segundos en una mini centrífuga.
Tras la mezcla final, centrifuga hasta un minuto para recoger el contenido. A continuación, utiliza una punta de microcargador para cargar uno o dos microlitros de mezcla de inyección en la aguja. Monta la aguja en el soporte y abre la punta arrastrando sobre cinta adhesiva de doble cara bajo aceite de halocarbono.
Y prueba el tamaño de la abertura usando la función limpia del microinyector. Coloca una pequeña gota de aceite de halocarbono sobre la almohadilla de 2%agarosa. Usando un microscopio diseccionador y un alambre de platino blando, recoge a un hermafrodita joven adulto.
Lávala con un tampón M9 para eliminar las bacterias. Transfiere el nematodo a una almohadilla de agarosa y colócala en una gota de aceite de halocarbono. Utiliza el alambre de platino suave para cepillar suavemente el nematodo hasta que quede inmovilizado.
Monta la almohadilla en la etapa de microinyección. Localiza un brazo gonadal y atravécalo con la aguja. Utiliza la función limpia del inyector para administrar la mezcla de inyección a 99 libras por pulgada cuadrada hasta que sea visible el flujo gonadial, confirmando el acceso del reactivo al sincicio.
Si es accesible, reposiciona el escenario e inyecta el segundo brazo gonadal de forma similar. Inmediatamente después de la inyección, resuspende el animal inyectado en uno o dos microlitros de tampón M9 sobre la almohadilla de agarosa. Utiliza un alambre fino de platino para retirar el gusano inyectado de la almohadilla, luego lava el aceite con buffer M9 y recupéralo sobre la placa de recuperación NGM sembrada con Comamonas aquatica.
Incuba la placa de recuperación a 25 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, aislar cada nematodo P0 inyectado en placas individuales de NGM sembradas con Xenorhabdus griffiniae. Se diseñaron dos ARN CRISPR dirigidos al homólogo Steinernema hermafrodito de unc-22 en sitios PAM previamente publicados.
El análisis de tirones de nematodos expuestos a nicotina mostró diferencias claras de movimiento entre mutantes unc-22 y nematodos de tipo salvaje. La genotipificación de los descendientes en espasmos por PCR mostró múltiples bandas tenues en el sitio objetivo tanto para Pam 3 como para Pam 5. La secuenciación confirmó los eventos de inserción y eliminación en el sitio UNC-22 objetivo.
Mi laboratorio ha ampliado mi trabajo postdoctoral en genética EPN. CRISPR está disponible ahora en tres especies de Steinernema. En este protocolo, establecimos una técnica eficiente para crear mutantes estables y hereditarios utilizando la edición genética CRISPR-Cas9.
Con una edición genética estable de CRISPR-Cas9, podemos diseccionar los mecanismos moleculares detrás de la simbiosis Steinernema-Xenorhabdus.
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Descripción general
Este artículo demuestra la ingeniería del genoma mediada por CRISPR-Cas9 en Steinernema hermaphroditum, un nematodo entomopatógeno y un modelo genético emergente. La tecnología es útil para crear mutantes que permitan elucidar las funciones génicas en la biología de nematodos relacionadas con la simbiosis mutualista y parasitaria.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Genética
- Microbiología
- Entomología
Antecedentes
- CRISPR-Cas9 es una herramienta potente para la edición del genoma.
- Steinernema hermaphroditum sirve como organismo modelo para el estudio de los nematodos.
- Comprender las funciones genéticas puede proporcionar información sobre las relaciones simbióticas.
- Los nematodos entomopatógenos son importantes para el control biológico de plagas.
Objetivo del estudio
- Demostrar la aplicación de CRISPR-Cas9 en nematodos.
- Crear mutantes para el análisis funcional de genes.
- Explorar la base genética de las interacciones mutualistas y parasitarias.
Métodos Utilizados
- Técnicas de edición del genoma CRISPR-Cas9.
- Generación y caracterización de mutantes.
- Análisis de la función génica en la biología de nematodos.
- Evaluación de comportamientos simbióticos y parasitarios.
Resultados principales
- Aplicación exitosa de CRISPR-Cas9 en Steinernema hermaphroditum.
- Creación de mutantes viables con funciones génicas alteradas.
- Conocimientos sobre los mecanismos genéticos subyacentes a las relaciones simbióticas.
- Implicaciones potenciales para las estrategias de control de plagas.
Conclusiones
- CRISPR-Cas9 es efectivo para la ingeniería del genoma en nematodos.
- Los mutantes proporcionan información valiosa sobre las funciones génicas.
- Esta investigación mejora la comprensión de la biología de los nematodos y sus aplicaciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La edición del genoma basada en CRISPR-Cas9 en Steinernema hermaphroditum permite una interrogación genética precisa de los mecanismos mutualistas y parasitarios en nematodos entomopatógenos. Esta plataforma facilita la validación funcional de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento, con implicaciones directas para la investigación traslacional en biotecnología agrícola y ecológica. La capacidad de generar y mantener líneas mutantes estables acelera la investigación y desarrollo basados en hipótesis, así como la selección de carteras para nuevos objetivos bioactivos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrupción dirigida de genes para aclarar las vías biológicas subyacentes a las interacciones nematodo-huésped y nematodo-bacterias.
- Apoya la validación funcional de genes candidatos implicados en mutualismo y parasitismo.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la generación de fenotipos observables vinculados a ediciones genéticas específicas.
- Mejora la confianza predictiva para la selección y priorización de objetivos posteriores.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona un sistema genéticamente manipulable para desarrollar y validar ensayos fenotípicos en nematodos.
- Permite la generación reproducible de líneas mutantes para flujos de trabajo de cribado estandarizados.
- Facilita la evaluación cuantitativa de la función génica mediante resultados fenotípicos observables.
- Agiliza el desarrollo de ensayos aprovechando la reproducción hermafrodita para establecer rápidamente líneas homocigotas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea la manipulación genética con modelos relevantes para enfermedades en la investigación de control de plagas agrícolas.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento de genes hasta la validación funcional en sistemas ecológicamente relevantes.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de dianas bioactivas para aplicaciones traslacionales.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Esta plataforma CRISPR-Cas9 sitúa a S. hermaphroditum como un modelo versátil para el descubrimiento temprano mediante la validación preclínica en la investigación de la biología de nematodos y simbiosis.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante mutagénesis dirigida y validación fenotípica.
- Selección: Proporciona líneas mutantes reproducibles para la estandarización de ensayos y lecturas cuantitativas.
- Análisis: Permite la medición de resultados fenotípicos, como el fenotipo de contracción, para comparar la función génica en distintas condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento científico con la investigación preclínica en modelos de control de plagas y simbiosis.
- Reutilización Empresarial: Establece un conjunto de herramientas genéticas reutilizable para la genómica funcional continua en NPE y especies relacionadas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de función génica.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo estandarizados, escalables y reproducibles para la manipulación genética.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del proyecto e inversiones en I+D eficientes en capital para nuevos objetivos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de objetivos genéticos para aplicaciones agrícolas y ecológicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microinyección y edición del genoma con CRISPR-Cas9.
- Necesita acceso a instrumentación para microinyección e infraestructura de biología molecular.
- Exige estandarización entre equipos para el mantenimiento de líneas mutantes y la validación fenotípica.
- La adaptación a otras especies EPN puede requerir optimización del protocolo.
- La validación fenotípica depende de resultados observables y cuantificables, como el fenotipo de temblor.
