Name: Mutagénesis basada en CRISPR-Cas9 en el nematodo entomopatógeno Steinernema hermaphroditum y el mantenimiento de líneas mutantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprende a aplicar CRISPR-Cas9 en Steinernema hermaphroditum para crear mutantes viables y estudiar funciones génicas en nematodos entomopatógenos. Este método potencia el control biológico de plagas.

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<ol><li>Stock, S., Blair, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts%3A+The+inside+out+of+a+mutualistic+association%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li>
<li>Murfin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode-bacterium+symbioses--cooperation+and+conflict+revealed+in+the+%26%2334%3Bomics%26%2334%3B+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bull%22%5BJournal%5D)">Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the &#34;omics&#34; age.</a> Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).</li>
<li>Dillman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+nematode+by+any+other+name%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic nematode by any other name.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).</li>
<li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), iyab170(2022).</li>
<li>Sergeant, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+typing%2C+and+insecticidal+activity+of+Xenorhabdus+isolates+from+entomopathogenic+nematodes+in+United+Kingdom+soil+and+characterization+of+the+xpt+toxin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).</li>
<li>Walsh, K. T., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+microbial+populations+in+Steinernema+%28Steinernematidae%2C+Nematoda%29+infected+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae.</a> J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+The+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).</li>
<li>Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nematode+age+and+culture+conditions+on+morphological+and+physiological+parameters+in+the+bacterial+vesicle+of+Steinernema+carpocapsae+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae).</a> J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).</li>
<li>Cao, M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready+or+Not%3A+Microbial+adaptive+responses+in+dynamic+symbiosis+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments.</a> J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).</li>
<li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathogens+as+biological+control+agents%3A+Back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).</li>
<li>Campos-Herrera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecific+virulence+of+entomopathogenic+nematodes+against+the+pests+Frankliniella+occidentalis+%28Thysanoptera%3A+Thripidae%29+and+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+toolbox+for+Photorhabdus+and+Xenorhabdus%3A+pSEVA+based+heterologous+expression+systems+and+CRISPR%2FCpf1+based+genome+editing+for+rapid+natural+product+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling.</a> Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).</li>
<li>Ratnappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+knockdown+by+microinjection+in+the+model+entomopathogenic+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).</li>
<li>Cao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+editing+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+genetically+manipulating+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes.</a> J Vis Exp. (181), e63885(2022).</li>
<li>Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+characterisation+of+Steinernema+hermaphroditum+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%2C+an+entomopathogenic+nematode+from+Indonesia%2C+and+its+phylogenetic+relationships+with+other+members+of+the+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus.</a> Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).</li>
<li>Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Steinernema+hermaphroditum+%28Nematoda%2C+Rhabditida%29%2C+from+West+Uttar+Pradesh%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India.</a> Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).</li>
<li>Schwarz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+and+its+associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+stable+intercellular+bridges+formed+by+incomplete+cytokinesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development.</a> Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+a+human-parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode.</a> PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).</li>
<li>Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+transfection+enhances+RNAi+and+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+non-model+nematode+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems.</a> Sci Rep. 9 (1), 483(2019).</li>
<li>Culp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+nematode+Caenorhabditis+briggsae+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system.</a> Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).</li>
<li>Hellekes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+gene+editing+in+non-model+nematode+Panagrolaimus+sp.+PS1159%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genome+Ed%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159.</a> Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).</li>
<li>Patel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+stable+transgenic+lines+in+the+human-infective+nematode+Strongyloides+stercoralis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis.</a> G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+Designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genome+editing+strategy+to+generate+putative+null+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9.</a> G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+Edits+from+Sanger+Trace+Data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> J Vis Exp. (91), e52096(2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+co-CRISPR+strategy+for+efficient+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).</li>
<li>Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+RNAi+in+Heterorhabditis+bacteriophora%3A+A+nematode+insect+parasite+and+host+for+insect+pathogenic+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts.</a> BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).</li>
<li>Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9%3A+A+new+tool+for+the+study+and+control+of+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites.</a> Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).</li>
<li>Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+parasitic+helminths%3A+A+brief+history+and+prospects+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future.</a> Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).</li>
<li>Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+peroxidase+gene+controlling+body+size+in+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum.</a> Genetics. 226 (2), (2024).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar (malla 80-100)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26411</td><td>También se utiliza en placas de piruvato LB</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td>También se utiliza en genotipado</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 trazrRNA</td><td>IDT</td><td>1072532</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nucleasa V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Agujas borosilicatas</td><td>Instrumento de Precisión Mundial</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol y piz;</td><td>VWR</td><td>433</td><td>5 mg/mL en etanol</td></tr><tr><td>Comamonas aquatica (DA1877)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tapa de vidrio para la almohadilla de agarosa</td><td>Laboratorios de investigación cerebral</td><td>#4860-1D</td><td>Espesor No1 de 48 x 60 mm</td></tr><tr><td>CRISPRScan</td><td></td><td></td><td>https://www.crisprscan.org/</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>Limpieza y concentrador de ADN-5&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector FemtoJet 4x con cabeza de agarre, portaagujas tamaño 4 0</td><td>Eppendorf/Calibre</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>Larvas de 5º estadio de Galleria melonella</td><td>GrubCo</td><td></td><td>https://www.grubco.com/index.cfm</td></tr><tr><td>Sistema de imagen en gel</td><td>Azure400</td><td>AZI400-01</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de carga en gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B72</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina (2%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>#41003</td><td></td></tr><tr><td>Cebadores de genotipado: DNA oligo, 25 nmol</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Triptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>También se usa en placas de piruvato LB oscuro y piruvato LB;</td></tr><tr><td>Extracto de levadura Gibco Bacto</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>También se usa en placas de piruvato LB oscuro y piruvato LB;</td></tr><tr><td>Set de cabezas de empuñadura, soporte aguja tamaño 1</td><td>Calibre</td><td>EPE-5196083008</td><td>(emparejado con aguja de borosilicato 1B120F-4)</td></tr><tr><td>Aceite de halocarbono 700</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Palilla de husillo de alambre platino duro para el mantenimiento diario</td><td>Investigación Tritech</td><td>PT-9901</td><td></td></tr><tr><td>Inferencia de ediciones CRISPR (ICE)</td><td>Synthego</td><td>N/A</td><td>Software utilizado para analizar secuencias de Sanger e identificar indels</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Extractor láser P-2000</td><td>Sutter</td><td>P-2000G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (MgSO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td>Para el buffer M9, también se usa en NGM</td></tr><tr><td>Punta de microcargador 2x96ST</td><td>Calibre</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de montaje para micromanipulador para Zeiss Axio Observer y Axiovert 200</td><td>Investigación Tritech</td><td>NZ-19-2</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Tritech</td><td>SMT1</td><td></td></tr><tr><td>Nicotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Buffer dúplex libre de nucleasas</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq MasterMix</td><td>NEB</td><td>M0486</td><td></td></tr><tr><td>Caja de almacenamiento de pipetas</td><td>Instrumentos Sutter</td><td>BX10</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, dibásico (K2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>KOH por NGM</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Para el buffer M9, también se usa en NGM</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de cuarzo</td><td>Instrumentos Sutter</td><td>QF100-70-10</td><td></td></tr><tr><td>S. hermaphroditium genoma</td><td>NCBI</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/</td></tr><tr><td>crRNAs sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>VWR</td><td>SS0430</td><td>También se usa en placas de piruvato M9, Dark LB, LB</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio, dibásico (Na2HPO4.7H20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390</td><td>Para el buffer M9</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td>También se usa en placas de piruvato LB y en la sección de Pescadores;</td></tr><tr><td>Palilla de hilo de platino blando para microinyección</td><td>Quemetales Surepure</td><td>6824</td><td>Platino 90%, Alambre de aleación de iridio 10%, 0,002 pulgadas de diámetro x 5 pies de largo</td></tr><tr><td>Portaagujas estándar</td><td>Investigación Tritech</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Steinernema hermaphroditum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>Inveta 3</td><td></td></tr><tr><td>Trehalosa</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-88195-99</td><td>0,08 M</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>pH 8,0</td></tr><tr><td>Preadolescentes 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de montaje de micromanipulador vertical</td><td>Investigación Tritech</td><td>NR2</td><td></td></tr><tr><td>Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mutagénesis basada en crispr-cas9 en el nematodo entomopatógeno steinernema hermaphroditum y el mantenimiento de líneas mutantes

CRISPR-Cas9-based Mutagenesis in the Entomopathogenic Nematode Steinernema hermaphroditum and the Maintenance of Mutant Lines

Mutagénesis basada en CRISPR-Cas9 en el nematodo entomopatógeno Steinernema hermaphroditum y el mantenimiento de líneas mutantes

Entomopathogenic nematodes (EPNs) in the genus Steinernema and Heterorhabditis maintain mutualistic interactions with Xenorhabdus and Photorhabdus ...

Estamos trabajando en la genética de la simbiosis bacteriana nematodo, que tiene aplicaciones agrícolas. Las herramientas genéticas en la bacteria Xenorhabdus están muy bien desarrolladas, pero la genética de la EPN sigue siendo limitada, basándose principalmente en pruebas de ARN y EMS. Para empezar, obtén placas de agar de nematodo sembradas con Xenorhabdus griffiniae y Comamonas aquaticus.Selecciona nematodos Steinernema hermaphroditum sobre las placas NGM preparadas que contienen Xenorhabdus griffiniae. Incubalos a 25 a 28 grados Celsius para un crecimiento óptimo. La noche antes de la microinyección, selecciona hermafroditas de la etapa J3 sobre placas de agar NGM frescas sembradas con Xenorhabdus griffiniae.El día de la microinyección, elige hermafroditas jóvenes adultos para la inyección. Extrae la secuencia génica objetivo del genoma de referencia de Steinernema hermafrodito usando BlastP. Selecciona un exón codificante temprano, preferiblemente el primero, e introduce la secuencia en CRISPRscan usando los ajustes por defecto para generar ARN CRISPR candidatos.Bombardea los principales ARN candidatos CRISPR contra el genoma de Steinernema hermafrodito para asegurarte de que no haya coincidencias fuera del objetivo. Almacena los ARN CRISPR seleccionados y los ARN CRISPR transactivadores universales a 100 micromolares cada uno en un buffer dúplex a menos 80 grados Celsius. Funde 2% de agarosa en agua usando un microondas.Transfiere 50 microlitros de la agarosa fundida a un vaso cubierto. Cúbrelo inmediatamente con un segundo vaso de tapa. Tras un tiempo de secado de 20 minutos, quita el cristal superior de la tapa y luego etiqueta la parte frontal de la almohadilla de agarosa.Guarda las almohadillas de agarosa a temperatura ambiente para un uso prolongado durante meses o años. Para preparar las agujas para la inyección, extrae capilares de cuarzo de un extractor de filamento láser y guarda las agujas en una caja de almacenamiento de pipetas. Prepara dúplexes de ARN guía frescos mezclando los crRNAs seleccionados y ARN CRISPR transactivadores universales en una proporción uno a uno.Incuba el tubo a 94 grados Celsius durante dos minutos, luego enfría hasta temperatura ambiente para recocer dúplex. Monta la mezcla de inyección combinando Cas9, cloruro de potasio y los dúplex de gRNA e incuba. Haz tres golpes en el tubo de PCR para mezclarlo y luego haz girar brevemente durante 10 a 15 segundos en una mini centrífuga.Tras la mezcla final, centrifuga hasta un minuto para recoger el contenido. A continuación, utiliza una punta de microcargador para cargar uno o dos microlitros de mezcla de inyección en la aguja. Monta la aguja en el soporte y abre la punta arrastrando sobre cinta adhesiva de doble cara bajo aceite de halocarbono.Y prueba el tamaño de la abertura usando la función limpia del microinyector. Coloca una pequeña gota de aceite de halocarbono sobre la almohadilla de 2%agarosa. Usando un microscopio diseccionador y un alambre de platino blando, recoge a un hermafrodita joven adulto.Lávala con un tampón M9 para eliminar las bacterias. Transfiere el nematodo a una almohadilla de agarosa y colócala en una gota de aceite de halocarbono. Utiliza el alambre de platino suave para cepillar suavemente el nematodo hasta que quede inmovilizado.Monta la almohadilla en la etapa de microinyección. Localiza un brazo gonadal y atravécalo con la aguja. Utiliza la función limpia del inyector para administrar la mezcla de inyección a 99 libras por pulgada cuadrada hasta que sea visible el flujo gonadial, confirmando el acceso del reactivo al sincicio.Si es accesible, reposiciona el escenario e inyecta el segundo brazo gonadal de forma similar. Inmediatamente después de la inyección, resuspende el animal inyectado en uno o dos microlitros de tampón M9 sobre la almohadilla de agarosa. Utiliza un alambre fino de platino para retirar el gusano inyectado de la almohadilla, luego lava el aceite con buffer M9 y recupéralo sobre la placa de recuperación NGM sembrada con Comamonas aquatica.Incuba la placa de recuperación a 25 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, aislar cada nematodo P0 inyectado en placas individuales de NGM sembradas con Xenorhabdus griffiniae. Se diseñaron dos ARN CRISPR dirigidos al homólogo Steinernema hermafrodito de unc-22 en sitios PAM previamente publicados.El análisis de tirones de nematodos expuestos a nicotina mostró diferencias claras de movimiento entre mutantes unc-22 y nematodos de tipo salvaje. La genotipificación de los descendientes en espasmos por PCR mostró múltiples bandas tenues en el sitio objetivo tanto para Pam 3 como para Pam 5. La secuenciación confirmó los eventos de inserción y eliminación en el sitio UNC-22 objetivo.Mi laboratorio ha ampliado mi trabajo postdoctoral en genética EPN. CRISPR está disponible ahora en tres especies de Steinernema. En este protocolo, establecimos una técnica eficiente para crear mutantes estables y hereditarios utilizando la edición genética CRISPR-Cas9.Con una edición genética estable de CRISPR-Cas9, podemos diseccionar los mecanismos moleculares detrás de la simbiosis Steinernema-Xenorhabdus.

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Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

La detección de mutantes con defectos fenotípicos es un método sencillo para identificar los genes que funcionan en un determinado proceso biológico. En este artículo se describe cómo los gusanos que viven la cultura libre (por...

Introducción al Laboratorio de Worm: El cultivo de gusanos de Mutagénesis

Aquí, presentamos un método para diseñar el genoma de C. elegans utilizando ribonucleoproteínas Cas9 CRISPR y plantillas de reparación dependiente de homología.

Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

Aquí, describimos un protocolo para introducir un knockout genético en el amastigote extracelular de Trypanosoma cruzi, utilizando el sistema CRISPR/Cas9. El fenotipo de crecimiento puede ser seguido ya sea por el recuento celular de la cultura axenic amastigote o por la proliferación de amastigotes intracelulares después de la invasión de la célula huésped.

Introducción de un Knockout Gene Directamente en la etapa de Amastigote de Trypanosoma cruzi usando el sistema CRISPR/Cas9

Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 se utiliza cada vez más para caracterizar la función génica en organismos no modelo. Este protocolo describe cómo generar líneas eliminatorias de Culex pipiens,desde la preparación de mezclas de inyección, hasta la obtención e inyección de embriones de mosquitos, así como la forma de criar, cruzar y detectar mosquitos inyectados y su progenie para detectar mutaciones deseadas.

Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9

Este protocolo detalla los pasos de crispr/cas9 mutagénesis dirigida en moscas de arena: recolección de embriones, inyección, cría de insectos e identificación, así como selección de mutaciones de interés.

Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Muchas características de la eusocialidad de los insectos se basan en la comunicación dentro de la colonia y la división del trabajo. La manipulación genética de genes reguladores clave en embriones de hormigas a través de microinyección y mutagénesis mediada por CRISPR proporciona información sobre la naturaleza del comportamiento altruista en insectos eusociales.

Inyecciones de embriones para la mutagénesis mediada por CRISPR en el saltador de la hormiga Harpegnathos

El objetivo de este protocolo es permitir la edición CRISPR/Cas9 sin fisuras del genoma de C. elegans utilizando complejos de ribonucleoproteína ensamblados y el marcador co-CRISPR dpy-10 para el cribado. Este protocolo se puede utilizar para realizar una variedad de modificaciones genéticas en C. elegans, incluidas inserciones, deleciones, reemplazos de genes y sustituciones de codones.

CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

Este estudio proporciona un procedimiento sistemáticamente optimizado de la construcción basada en ribonucleasa CRISPR / Cas9 de mutantes de langosta homocigota, así como un método detallado para la criopreservación y reanimación de los huevos de langosta.

Construcción de mutantes homocigotos de langostas migratorias utilizando tecnología CRISPR/Cas9

Los nematodos entomopatógenos viven en simbiosis con las bacterias y juntos infectan con éxito a los insectos al socavar su sistema inmunológico innato. Para promover la investigación sobre la base genética de la infección por nematodos, se describen métodos para mantener y manipular genéticamente los nematodos entomopatógenos.

Cultivo y manipulación genética de nematodos entomopatógenos

Aprende a aplicar CRISPR-Cas9 en Steinernema hermaphroditum para crear mutantes viables y estudiar funciones génicas en nematodos entomopatógenos. Este método potencia el control biológico de plagas.

Mutagénesis basada en CRISPR-Cas9 en el nematodo entomopatógeno Steinernema hermaphroditum y el mantenimiento de líneas mutantes (Video) | JoVE Journal

Mutagénesis basada en CRISPR-Cas9 en el nematodo entomopatógeno Steinernema hermaphroditum y el mantenimiento de líneas mutantes

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