Ensayo de salida de fosfolípidos específicos de lipoproteínas de alta densidad

Desarrollamos un ensayo sustituto para medir la eliminación mediada por HDL de los lípidos de la placa de las arterias coronarias y así evaluar el riesgo de enfermedad de las arterias coronarias. El desafío actual es desarrollar un ensayo de influjo lipídico HDL sencillo, rápido y robusto tanto para aplicaciones de investigación como clínicas. Para empezar, añade todo el contenido necesario en un vaso bajo una campana extractora química y haz un vórtice breve de la mezcla lipídica para mezclar las soluciones.

Seca la mezcla en un tubo de vidrio bajo un suave chorro de nitrógeno durante una hora para formar una película lipídica seca en el fondo del tubo. Para recubrir el hidrato de silicato de calcio, inserta un cono de papel de pesaje en el tubo de vidrio que contiene los lípidos secos y añade 80 miligramos de polvo de hidrato de silicato de calcio en el tubo usando el cono para dirigir el polvo a la base. Inmediatamente añade 2 mililitros de solución fisiológica normal al tubo y cubre la parte superior con Parafilm.

Haz un vórtice manual en el tubo de vidrio para desalojar la mayor parte del lípido desde el fondo. Coloca el tubo de cristal en un orificio hecho en una plataforma de poliestireno unida a un vórtice y asegura el tubo a la plataforma del vórtice usando cinta reforzada. Haz un vórtice en el tubo de cristal durante 10 minutos y confirma que no quedan lípidos en la pared del tubo.

Transfiere el contenido del tubo de vidrio a un tubo cónico de plástico de 15 mililitros usando una pipeta de 1 mililitro. Lava el tubo de cristal con 3 mililitros de suero fisiológico y transfiere el lavado al mismo tubo de 15 mililitros. A continuación, coloque el tubo de plástico de 15 mililitros que contiene hidrato de silicato de calcio recubierto de lípidos en una centrífuga y centrifuge a 935 G durante 2 minutos a 4 grados Celsius.

Utiliza una punta de pipeta larga y fina para aspirar el sobrenadante. Comenzando desde la parte superior del sobrenadante, desliza la punta de la pipeta lentamente por el lateral del tubo mientras aspiras. Inclina ligeramente el tubo durante la aspiración y deja aproximadamente 200 microlitros de suero fisiológico sobre el pellet para evitar que se altere.

Luego, añade solución salina para llevar el volumen total a 5 mililitros. Repite la centrifugación y la extracción del sobrenadante cuatro veces. Tras el lavado final, añadir suero salino para llevar el volumen total a 2,5 mililitros Pipeta 75 microlitros de solución salina en cada pozo de una placa de 0,3 mililitros de 96 pozos según el número de pozos necesarios para el conjunto de muestras.

Vortex, el tubo de plástico de 15 mililitros que contiene LC-CSH, tres veces durante 10 segundos cada una. Utilizando una pipeta de un solo pozo, dispensa 50 microlitros de LC-CSH a lo largo del lado derecho del pozo que contiene solución salina. Después de tres pozos, repite el protocolo de vórtice antes de dispensar en los siguientes tres pozos.

Gira la placa de 96 pozos 180 grados para que el lado izquierdo de los pozos quede ahora hacia la derecha. Pipetear 25 microlitros de muestras de plasma o suero a lo largo del lado derecho de cada pozo. Para los pozos control positivos, añadir 25 microlitros de plasma o suero normal lipídemico humano estándar de referencia.

A continuación, sella la placa de 96 pozos firmemente con película adhesiva e incuba la placa sellada en la oscuridad durante una hora a 37 grados Celsius y 1.200 revoluciones por minuto en un termomezclador. Tras la incubación, retira la placa del termomezclador y colócala sobre hielo. Centrifuga la placa durante dos minutos a 935G a 4 grados Celsius para pelletar las partículas donantes y detener la reacción de transferencia.

Ahora, retira cuidadosamente la película adhesiva de la placa de 96 pozos sin alterar el perdigón LC-CSH. Transfiere 50 microlitros de sobrenadante desde la placa de reacción a los pozos de una placa negra de poliestireno de fondo plano de 96 pozos utilizando una pipeta de varios pozos. Llena un depósito con solución salina normal y añade 50 microlitros de suero a cada pozo.

Usando una pipeta de varios pozos. Prepara un 1% de Triton X-100 en un matraz de plástico Erlenmeyer de 125 mililitros. Llena un depósito con el Triton X-100 preparado al 1% y añade 100 microlitros de la misma solución a temperatura ambiente en cada pozo.

Mezcla suavemente con la tubería subiendo y bajando dos o tres veces con una pipeta multi-pozo y haz explotar las burbujas usando aire de una pipeta de transferencia de 3 mililitros. Finalmente, medir la fluorescencia de la lisamina rodamina usando un fluorómetro con excitación a 540 nanómetros y emisión a 600 nanómetros. Se generó una curva estándar utilizando LC-CSH marcado por LRHPE diluido en serie y mostró una respuesta de fluorescencia altamente lineal.

En el estudio de la curva de concentración plasmática, se dispensaron volúmenes crecientes de plasma humano agrupado en pozos triplicados junto con controles de solución salina. La curva de respuesta a la dosis plasmática mostró una excelente linealidad entre PE, afflujo y volumen plasmático, con una fuerte correlación en el rango de 15-35 microlitros. Nuestro protocolo sencillo y rápido, que predice el riesgo incidente de enfermedades cardiovasculares, puede utilizarse tanto para investigación como para estudios clínicos diagnósticos.

Nuestros hallazgos demuestran que nuestro ensayo puede esclarecer el papel tanto de los lípidos celulares como extracelulares de la placa en las enfermedades cardiovasculares.