Name: Imágenes de calcio in vivo y ex vivo de una neurona del circuito olfativo en la larva de Drosophila melanogaster de tercer estadio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Aprende a realizar imágenes de calcio in vivo y ex vivo en neuronas del circuito olfativo de larvas de Drosophila melanogaster usando adhesivo tisular GLUture. Este método mejora la estabilidad y accesibilidad en investigación neurofisiológica.

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1. Preparación de larvas de Drosophila de tercer estadio para imágenes de calcio
<ol>
	<li>Mantenga las moscas con alimento estándar para moscas (ver Tabla de materiales) a 25 °C, con 50-60% de humedad relativa (HR) y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.</li>
	<li>Para expresar la proteína fluorescente roja (RFP) para la identificación de neuronas y GCaMP6f (indicador de calcio) en la(s) neurona(s) de interés ('X'), cruce hembras vírgenes de la línea X-Gal4 con machos portadores de UAS-GCaMP6f y UAS-tdTomato22. NOTA: Para este estudio, se utilizó la línea Keystone-Gal4 para impulsar la expresión de tdTomato y GCaMP6f en un solo par de neuronas locales inhibidoras (Keystone-LN) en el cerebro larvario 18,19.</li>
	<li>Después de permitir que las moscas macho y hembra se apareen y pongan huevos durante 48 h, transfiera los adultos a un vial nuevo.</li>
	<li>Extraiga las larvas de tercer estadio (aproximadamente 120 h después de la puesta de huevos) flotándolas sobre una solución de sacarosa al 15%. Utilice una micropipeta P1000 para transferir las larvas flotantes a un vaso de precipitados de vidrio de 1.000 ml.</li>
	<li>Lave las larvas 3-4 veces reemplazando el agua en el vaso de precipitados con 800 ml de agua destilada fresca cada vez. Deje que las larvas descansen durante 10 minutos antes de continuar con el resto del protocolo.</li>
</ol>
2. Protocolo de inanición para larvas de Drosophila de tercer estadio (si se prueban condiciones de hambre frente a no hambrientas)
<ol>
	<li>Prepare dos cámaras de alimentación colocando un pequeño cuadrado de toallita de laboratorio en placas de Petri de 6 cm. Para condiciones que no mueran de hambre, agregue 350 μL de solución de sacarosa 0.2 M; para condiciones de hambruna, agregue 350 μL de agua destilada.</li>
	<li>Transfiera un número igual de larvas lavadas a cada cámara de alimentación. Deje que las larvas se alimenten de sacarosa (no hambrienta) o agua destilada (hambrienta) durante 2 h a temperatura ambiente.</li>
</ol>
3. Imágenes de calcio in vivo
NOTA: Todos los experimentos que involucren el adhesivo tisular deben realizarse utilizando prácticas de seguridad estándar de laboratorio. Se requiere equipo de protección personal (EPP), incluidos guantes de nitrilo, bata de laboratorio y gafas de seguridad o un protector facial; Deben evitarse los guantes de algodón debido a reacciones exotérmicas con cianoacrilato. Evite el contacto del adhesivo con la piel, los ojos o las membranas mucosas. En caso de unión de la piel, remoje el área en agua tibia y jabón y separe suavemente; En caso de exposición ocular, enjuague con agua tibia durante ≥5 min y busque atención médica inmediata. El adhesivo debe mantenerse alejado de llamas abiertas y altas temperaturas, ya que el adhesivo curado puede liberar humos irritantes si se quema. Guarde el adhesivo a ≤30 °C, lejos de la humedad y la luz solar directa, en un recipiente herméticamente cerrado cuando no esté en uso.
<ol>
	<li>Prepare el tampón de imagen de calcio con la siguiente composición: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucosa 10 mM y HEPES 10 mM. Almacenar a 4 °C cuando no esté en uso. NOTA: La solución salina modificada que contiene 110 mM de NaCl es una formulación ampliamente aceptada para la disección e imagen del SNC larvario y se encuentra dentro del rango típico utilizado en electrofisiología y estudios de imágenes (≈108-128 mM de NaCl)23,24,25,26.</li>
	<li>En un cubreobjetos de microscopio de 24 x 50 mm (1,5 mm de grosor), cree un pocillo con vaselina dispensada de una jeringa.</li>
	<li>Coloque una pequeña gota de adhesivo tisular tópico (60% de 2-octilo y 40% de cianoacrilato de n-butilo) en el centro de la cubierta de vidrio. Extienda el adhesivo uniformemente en una capa delgada y uniforme con una varilla de vidrio.</li>
	<li>Transfiera con cuidado una sola larva sobre el adhesivo con un cepillo o un alambre delgado. Presione suavemente el lado ventral de la larva sobre el adhesivo. Deje que el adhesivo se seque, asegurándose de que la larva esté completamente inmovilizada.</li>
	<li>Una vez que la larva esté inmovilizada, coloque el cubreobjetos en la platina de microscopio invertida (Figura 1A).</li>
</ol>
4. Imágenes de calcio ex vivo
<ol>
	<li>Prepare el tampón de disección larvaria con la siguiente composición: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 0,3 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucosa 10 mM y HEPES 10 mM. Almacenar a 4 °C cuando no esté en uso.</li>
	<li>Diseccionar las disecciones cerebrales descritas por Ishimoto y Sano10. Brevemente, con un cepillo o alambre delgado, transfiera una sola larva a una placa de Petri de 3,5 cm con elastómero de silicona en capas en la parte inferior.</li>
	<li>Bajo un microscopio de disección, coloque la larva con su lado ventral hacia arriba y localice el cerebro. Con unas tijeras de disección, haga un corte de aproximadamente un tercio del extremo anterior de la larva. Haz otro corte en los ganchos de la boca. Preservar el cerebro mientras se quitan los ganchos del cuerpo y la boca (adaptado de Janelia Flylight Protocol27).</li>
	<li>Identificar el grupo de nervios que contienen neuronas motoras del cordón ventral. Con fórceps, separe suavemente el cerebro del resto de la larva disecada. Recorta cualquier exceso de tejido del cerebro. NOTA: Manejar suavemente la fuerza excesiva puede causar daño tisular ya que el cerebro es frágil.</li>
	<li>Prepare un cubreobjetos de microscopio con el adhesivo tisular para obtener imágenes de calcio como se describe en los pasos 3.2 a 3.3.</li>
	<li>Con una micropipeta P10, aspire cuidadosamente el cerebro diseccionado con 5 μL de solución de disección de la placa de Petri. Expulse lentamente el cerebro sobre el adhesivo. Antes de que el adhesivo se seque, oriente el cerebro en una posición dorsal hacia arriba (con los dos lóbulos cerebrales hacia abajo y el cordón ventral dorsal hacia arriba).</li>
	<li>Con una micropipeta P200, transfiera 100 μl del tampón de imágenes de calcio sobre el cerebro larvario inmovilizado en el cubreobjetos.</li>
	<li>Coloque el cubreobjetos con el cerebro en el microscopio invertido, conectado a un módulo de escáner confocal de disco giratorio y una cámara CCD para obtener imágenes de calcio (Figura 1B). NOTA: Para preparaciones ex vivo , asegúrese de orientar el cerebro correctamente mientras el pegamento aún está húmedo. Para una calidad de imagen óptima, coloque el cerebro de manera que el ROI esté más cerca del objetivo del microscopio y evite aplicar exceso de pegamento cerca del ROI.</li>
</ol>
5. Protocolo de imagen
<ol>
	<li>Abra el software para obtener imágenes de calcio con el microscopio confocal. Capture imágenes utilizando un objetivo de 10x/1,4 NA con cambio de filtro entre láser GFP (excitación 488 nm, intensidad 70%, emisión 525 nm/50 m, OD8) y láser RFP (excitación 561 nm, intensidad 50%, emisión 610 nm/75 m, OD8). Establezca la exposición entre 100 ms y 1.000 ms, la ganancia al 50% del valor de exposición correspondiente y un factor de agrupación de 2 durante la captura de la imagen.</li>
	<li>Ajuste el microscopio a un aumento de 10x y ubique el cerebro bajo iluminación de campo claro.</li>
	<li>Identifique la neurona de interés buscando la señal tdTomato con el láser RFP (excitación establecida en 561 nm). NOTA: Seleccione saturación y reduzca gamma para establecer el valor de exposición correcto.</li>
	<li>Una vez identificada la región de interés (ROI), cambie al láser GFP (excitación establecida en 488 nm) para capturar señales GCaMP6f. Asegúrese de que las señales tdTomato y GCaMP se colocalicen antes de capturar imágenes de pila de ambos canales. NOTA: Ajuste la configuración de imagen para las grabaciones de pila tdTomato y GCaMP6f para maximizar la fluorescencia.</li>
	<li>Capture dos grabaciones de series temporales separadas de señales tdTomato y GCaMP6f simultáneamente a una velocidad de 0,5 fotogramas/s (durante un total de 2 min). NOTA: El cerebro larvario diseccionado permanece viable durante aproximadamente 10 min en estas condiciones de amortiguación; Después de este tiempo, las señales se degradarán.</li>
	<li>Una vez que la muestra esté lista para la imagen, capture dos grabaciones de series temporales separadas de señales tdTomato y GCaMP6f simultáneamente a una velocidad de 0,5 fotogramas/s (durante un total de 2 min). NOTA: El cerebro larvario diseccionado permanece viable durante aproximadamente 10 min en estas condiciones de amortiguación; Después de este tiempo, las señales se degradarán. NOTA: Al realizar un análisis cuantitativo, recomendamos aumentar la potencia del láser y ajustar la ganancia de exposición del detector según sea necesario mientras se mantiene la escala de intensidad lineal.</li>
</ol>
6. Tratamiento y análisis de datos
<ol>
	<li>Abra e importe las pilas de señales tdTomato y GCaMP6f en ImageJ (NIH)28.</li>
	<li>Para identificar la región de interés (ROI) correcta, combine las señales tdTomato y GCaMP6f para confirmar la colocalización. Después de la verificación, divida los canales tdTomato y GCaMP6f.</li>
	<li>En el menú superior, selecciona Plugins | Nuevo y haga clic en Macros para iniciar una nueva macro. A continuación, importe las macros personalizadas basadas en ROI a ImageJ. Seleccione la pila GCaMP6f y presione Ejecutar para el análisis de calcio.</li>
	<li>Procese las señales de fluorescencia utilizando una macro ImageJ personalizada (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). La macro primero genera proyecciones de máxima intensidad, realiza la corrección de movimiento usando el complemento StackReg (modo de registro rígido )29 y aplica la corrección de decoloración.</li>
	<li>Aparecerá una ventana emergente de "Acción requerida" solicitando la selección manual del ROI, lo que permite a los usuarios obtener manualmente un ROI amplio. Haga clic en Aceptar para continuar con el análisis. Para llevar a cabo la corrección de movimiento, asegúrese de que el cuadro rectangular cubra todo el ROI en todos los fotogramas para una corrección de movimiento precisa mientras conserva la forma espacial local y de ROI en todos los fotogramas. NOTA: Las grabaciones se registraron en ImageJ usando StackReg. Cuando el movimiento en el plano era grande (desplazamiento XY acumulativo &gt; 1 μM) o la deriva Z axial provocaba pérdida de enfoque, el registro se volvía poco fiable o la muestra se perdía por completo de la ventana de imagen. Por lo tanto, las muestras que mostraban una deriva extrema o señales de calcio en declive (&gt;30%) se etiquetaron automáticamente y se excluyeron del análisis posterior para garantizar mediciones precisas de la actividad neuronal. Estos umbrales son consistentes con las prácticas de control de calidad comúnmente aplicadas en los estudios de imágenes de calcio 30,31,32,33. La exclusión también aseguró que solo se usaran registros estables con transitorios de calcio ligados a estímulos confiables para los análisis.</li>
	<li>Para el análisis, extraiga trazas de fluorescencia de ROI circulares definidas manualmente, guiadas por autocorrelación de píxeles; estos ROI abarcarán todo el campo de neuronas clave.<ol>
		<li>Extraiga los datos de intensidad de fluorescencia sin procesar para dos fluoróforos: GCaMP6f/GFP y tdTomato/RFP, utilizando macros personalizadas en ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, consulte la tabla de materiales).</li>
		<li>Aplique una ventana deslizante con un ROI de 20 x 20 píxeles y un tamaño de paso de 10 píxeles en todo el campo de visión. Para cada ROI, la macro calculará: (1) la intensidad en todos los fotogramas, (2) la diferencia de fluctuación de referencia (es decir, la diferencia entre los valores de intensidad máxima y mínima durante los primeros 10 fotogramas) y (3) el cambio máximo de intensidad de fotograma a fotograma (ΔF). Se eliminarán los ROI que muestren fluctuaciones de intensidad inferiores a 10 unidades, y solo se seleccionarán los valores de ΔF más nítidos para un análisis más detallado.</li>
		<li>Normalice los rastros de fluorescencia utilizando los siguientes métodos:<ol>
			<li>Normalización de Fmax y Fmin: Calcule Δ normalizado usando la fórmula: 
			<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68956/68956eq1.jpg" style="margin: auto;"> Donde F es la fluorescencia sin procesar en cada punto de tiempo, Fmin es la fluorescencia mínima (línea de base) y Fmax es la fluorescencia máxima durante la grabación.</li>
			<li>Normalización ΔF/F 0: Además, realice la normalización ΔF/Fo, donde Fo (línea de base) está determinado por los primeros 10 fotogramas de cada grabación, utilizando la fórmula: 
			<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68956/68956eq2.jpg" style="margin: auto;"> Donde Ft es la fluorescencia en el tiempo t y F0 es el valor de referencia calculado a partir de los primeros 10 fotogramas.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Después de extraer las señales GCaMP6f, haga clic con el botón izquierdo y seleccione todo, corte y pege para transferir todos los valores a una nueva hoja de cálculo de Excel. En la barra de menús superior, selecciona Datos | Texto a columnas. Aparecerá una ventana emergente del asistente "Texto a columna ". En el paso 1, selecciona Delimitado y, a continuación, haz clic en Siguiente. En el paso 2, en Delimitadores, seleccione Tabulador y coma y, a continuación, haga clic en Siguiente. En el paso 3, seleccione Finalizar. OPCIONAL: Para trazar las señales de calcio normalizadas, resalte Fnorm_FminFmax y seleccione Gráfico de dispersión.</li>
	<li>Busque un archivo .csv que se genere que contenga: (1) valores de fluorescencia sin procesar F, (2) ΔF/Fo y (3) Fnorm (intensidad de fluorescencia normalizada). Organice el conjunto de datos final en cuatro columnas: (1) tiempo (marcos), (2) condición de la muestra (hambriento o alimentado), (3) ID de replicación (muestra individual) y (4) intensidad normalizada (valores Fnorm escalados de 0 a 1).</li>
	<li>Por último, realice el análisis y la visualización de datos en R mediante scripts de R personalizados (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, consulte Tabla de materiales).<ol>
		<li>Importe el script de R personalizado en un nuevo proyecto de R. Asegúrese de que los paquetes de R necesarios, incluidos ggplot2, dplyr y readr, estén instalados y actualizados antes de ejecutar el análisis.</li>
		<li>A partir de la línea 1 del script de R personalizado, presione Ejecutar continuamente para realizar el análisis de calcio. Asegúrese también de que la salida incluya mapas de calor que ilustren la intensidad de calcio normalizada para los primeros 30 fotogramas, 60 fotogramas y todos los fotogramas de la grabación de series temporales, y diagramas de caja para mostrar la mediana de las intensidades normalizadas.</li>
		<li>Evaluar la importancia de la intensidad de calcio normalizada mediante la prueba U de Mann-Whitney.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Eliminación y descontaminación de residuos
<ol>
	<li>Después de los experimentos, elimine los desechos gruesos de las herramientas y superficies con agua corriente, luego desinfecte con etanol al 70% o lejía al 10% seguido de agua estéril. Trabaje sobre una superficie desinfectada y lávese las manos después de quitarse los guantes; No coma ni beba en el laboratorio.</li>
	<li>Coloque el tejido larvario y los desechables contaminados en bolsas de riesgo biológico y autoclave antes de desechar.</li>
	<li>Deseche los desechos adhesivos completamente curados en la basura general; El adhesivo no curado y los desechables contaminados deben recolectarse en un contenedor de desechos químicos peligrosos sellado y etiquetado.</li>
	<li>Coloque todos los objetos punzantes (cuchillas, agujas, vidrios rotos) en un recipiente resistente a los pinchazos.</li>
	<li>Recoger disolventes inflamables (etanol, acetona) en contenedores de residuos inflamables etiquetados.</li>
</ol>

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<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).</li>
<li>Larval Dissection. , Howard Hughes Medical Institute. 
 <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o">https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o</a> (2019).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+an+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: an open platform for biomedical image analysis.</a> Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>De Vries, S. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+standardized+physiological+survey+reveals+functional+organization+of+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex.</a> Nat Neurosci. 23 (1), 138-151 (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+sensory+transmission+and+neuronal+plasticity+in+primary+sensory+neurons+with+a+positively+tuned+voltage+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with a positively tuned voltage indicator.</a> Nat Commun. 16 (1), 6396(2025).</li>
<li>Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+facilitation+by+neuropeptide+signaling+mediates+odor-driven+food+search%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search.</a> Cell. 145 (1), 133-144 (2011).</li>
<li>Slankster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+underlying+starvation-dependent+modulation+of+olfactory+behavior+in+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva.</a> Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).</li>
<li>Lehnert, B. P., Baker, A. E., Gaudry, Q., Chiang, A. S., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+TRP+channels+in+auditory+transduction+and+amplification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of TRP channels in auditory transduction and amplification in Drosophila.</a> Neuron. 77 (1), 115-128 (2013).</li>
<li>Murthy, M., Turner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+in+vivo+patch-clamp+recordings+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn%3A+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li>
<li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li>
<li>Simpson, J. H., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+and+optogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional imaging and optogenetics in Drosophila.</a> Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Acciones y Fly Stocks Mantenimiento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimento para moscas nutrifly</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-112</td><td></td></tr><tr><td>UAS-GCaMP6f, tdTomato</td><td>Donación del Dr. JH Kim&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)</td><td>BDSC</td><td>49232</td><td></td></tr><tr><td>Protocolo de reactivos para la inanición</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 6 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106G</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos para la imagen y el tampón de disección</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>J.T. Baker, Avantor Sciences</td><td>JT1311-1</td><td>CAS: 1311-01, 500g</td></tr><tr><td>D-(+)-glucosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16828.36</td><td>CAS: 50-99-7, 500g</td></tr><tr><td>HEPES-2-[4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinilo]-ácido etanosulfónico</td><td>J.T. Baker, Avantor Sciences</td><td>JT4018-1</td><td>CAS: 4018-01, 100g</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>VWR</td><td>97064-150</td><td>CAS: 7786-30-3, 100g</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J64189.36</td><td>CAS: 7447-40-7, 500g</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>EMD Milipore Sigma</td><td>EMD-SX0420-1</td><td>CAS: 7647-14-5, 500g</td></tr><tr><td>Herramientas y reactivos para la disección</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amortiguador de disección</td><td></td><td></td><td>Composición proporcionada en el texto</td></tr><tr><td>Placas de Petri Olympus, 60 x 15mm ventiladas</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-105</td><td></td></tr><tr><td>Base de elastómero Sylgard 184</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>24236-10A</td><td></td></tr><tr><td>Agente de curado con base elastómera Sylgard 184</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>24236-10B</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Estilo 5, EMS</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>78320-5</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de muelle Vannas - Filo de 3 mm</td><td>Herramientas Científicas Fines</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Imagenología y Equipamiento/Reactivos de montaje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Módulo de escáner confocal</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-W1</td><td>Conectado al microscopio</td></tr><tr><td>Búfer de imagen</td><td></td><td></td><td>Composición proporcionada en el texto</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8&nbsp;</td><td>Conectado a un módulo de escáner confocal de disco giratorio y a una cámara CCD</td></tr><tr><td>Vidrio de cubierta de microscopio, 24mm x 50mm, grosor # 1,5</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo tópico MWI Veterinary GLUTURE</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0632797</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina pura</td><td>Walgreens</td><td>912556</td><td></td></tr><tr><td>Enlaces a recursos públicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioRender</td><td></td><td></td><td>https://www.biorender.com/</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>912556</td><td>https://imagej.net/ij/</td></tr><tr><td>Vídeo del protocolo Janelia Flylight</td><td>https://www.janelia.org/</td><td></td><td>https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o</td></tr><tr><td>Mathew Lab Github</td><td></td><td></td><td>https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging</td></tr></tbody></table>

imágenes de calcio in vivo y ex vivo de una neurona del circuito olfativo en la larva de drosophila melanogaster de tercer estadio

In-vivo and Ex-vivo Calcium Imaging of an Olfactory Circuit Neuron in the Third-Instar Drosophila melanogaster Larva

Para demostrar nuestro enfoque de imágenes de calcio larvario, lo aplicamos con éxito a preparaciones in vivo y ex vivo de las larvas de Drosophila (Figura 2 y Figura 3, Video 1, Video 2, Video 3 y Video 4). Medimos la dinámica del calcio en larvas de Drosophila de tercer estadio que expresan GCaMP6f y Td-Tomato en un solo par de Keystone-LN en el cerebro larvario<sup class="x...

Imágenes de calcio in vivo y ex vivo de una neurona del circuito olfativo en la larva de Drosophila melanogaster de tercer estadio

Calcium imaging is crucial for studying neural dynamics and brain function. However, current methods for imaging calcium in Drosophila larvae are ...

in-vivo-ex-vivo-calcium-imaging-an-olfactory-circuit-neuron-third

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Investigación

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Neurociencia

Este protocolo describe un método fiable para la anestesia y la imagen intacta...

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

Se describe una técnica establecida para medir y analizar el olor de respuestas evocadas de calcio en el lóbulo antenal de...

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

Este video describe las imágenes de calcio in vivo en neuronas de Drosophila usando GCaMP. El clip de protocolo presentado muestra cómo registrar los cambios en la fluorescencia de GCaMP de las neuronas del cuerpo del hongo durante un experimento de acondicionamiento olfativo.

Drosophila in vivo Imágenes de calcio: un método para obtener imágenes funcionales de la actividad neuronal

Este video muestra un método para obtener imágenes de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en moscas. Describe los pasos para preparar las moscas para la microscopía, realizar el acondicionamiento olfativo y visualizar la afluencia de calcio inducida por el olor.

in vivo Imágenes de calcio utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en Drosophila melanogaster

Fuente: Ishimoto, H. et. al., Imágenes de calcio ex vivo para visualizar las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Este video muestra las imágenes de calcio para estudiarDrosophila respuestas cerebrales a los neuropéptidos. Las neuronas que expresan un indicador de calcio fluorescente revelan la dinámica del calcio intracelular y las respuestas funcionales a las moléculas de señalización.

Imágenes de calcio ex vivo para estudiar las respuestas cerebrales de Drosophila a los neuropéptidos

Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

Este papel describe un protocolo para ex vivo calcio la proyección de imagen del cerebro de Drosophila . En este método, compuestos naturales o sintéticos pueden aplicarse en el búfer para poner a prueba su capacidad para activar las neuronas particular en el cerebro.

Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

Aquí presentamos un protocolo con el que el calcio pre y/o postsináptico se puede visualizar en el contexto del aprendizaje y la memoria de Drosophila. La imagen de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinaptically se combina con un paradigma de acondicionamiento olfativo clásico de tal manera que se puede determinar la plasticidad sináptica subyacente a este tipo de aprendizaje asociativo.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Aquí, discutimos un flujo de trabajo para preparar, diseccionar, montar y obtener imágenes de cerebros de explante vivos de larvas del tercer estadio de Drosophila melanogaster para observar la dinámica celular y subcelular en condiciones fisiológicas.

Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Aquí, presentamos un protocolo para la obtención de imágenes de calcio ex vivo en Drosophila adulta que expresa GCaMP6 para monitorear las actividades epileptiformes. El protocolo proporciona una herramienta valiosa para investigar eventos ictales en Drosophila adulta a través de imágenes de calcio ex vivo , lo que permite explorar los posibles mecanismos de la epilepsia a nivel celular.

Ex Vivo Imágenes de calcio para el modelo de epilepsia de Drosophila

Un enfoque de imágenes de calcio permite el registro de las respuestas inducidas por el gusto en el cerebro de moscas despiertas mientras se aplica una solución al labelo. Las respuestas gustativas primarias en Drosophila melanogaster se utilizan como ejemplo, pero este protocolo se puede adaptar para estudiar neuronas aguas abajo u otras especies.

In vivo Imágenes de calcio de las respuestas neuronales inducidas por el gusto en Drosophila adulta

Aprende a realizar imágenes de calcio in vivo y ex vivo en neuronas del circuito olfativo de larvas de Drosophila melanogaster usando adhesivo tisular GLUture. Este método mejora la estabilidad y accesibilidad en investigación neurofisiológica.

Imágenes de calcio in vivo y ex vivo de una neurona del circuito olfativo en la larva de Drosophila melanogaster de tercer estadio (Video) | JoVE Journal

Imágenes de calcio in vivo y ex vivo de una neurona del circuito olfativo en la larva de Drosophila melanogaster de tercer estadio

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