Imágenes de calcio in vivo y ex vivo de una neurona del circuito olfativo en la larva de Drosophila melanogaster de tercer estadio

Este protocolo utiliza adhesivo tisular GLUture para mejorar la capacidad de obtener imágenes de calcio in vivo y ex vivo. Esto permite a los investigadores comprender la dinámica del calcio en una neurona del circuito olfativo en larvas de Drosophila de tercer estadio. La simplicidad y la rentabilidad son las dos principales ventajas de esta técnica, lo que hace que los experimentos sean más confiables y accesibles en la investigación neurofisiológica.

Prepare dos cámaras de alimentación colocando un pequeño cuadrado de toallita química en placas de Petri de seis centímetros. Para condiciones de hambruna, agregue 350 microlitros de agua destilada. Para condiciones que no mueran de hambre, agregue 350 microlitros de solución de sacarosa 0.2 molar.

Transfiera un número igual de larvas lavadas a cada cámara de alimentación. Deje que las larvas se alimenten de sacarosa, agua destilada o sin hambre, durante dos horas a temperatura ambiente En un vidrio de cubierta de microscopio de 24 por 50 milímetros y 1,5 milímetros de espesor, cree un pozo, utilizando vaselina dispensada de una jeringa. Coloque una pequeña gota de adhesivo de tejido tópico GLUture en el centro de la cubierta de vidrio.

Extienda la GLUture uniformemente en una capa delgada y uniforme, usando una varilla de vidrio. Transfiera con cuidado una sola larva a la GLUture con un cepillo o alambre delgado. Presione suavemente el lado ventral de las larvas sobre el adhesivo.

Deje que la GLUture se seque, asegurándose de que las larvas estén completamente inmovilizadas. Una vez que las larvas estén inmovilizadas, sumérjalas en 100 microlitros de tampón de imágenes. Coloque el cubreobjetos en un microscopio invertido Leica DMi8, conectado a un módulo de escáner confocal de disco giratorio Yokogawa CSU-W1 y una cámara CCD para obtener imágenes de calcio.

Prepare un cubreobjetos de microscopio con GLUture para obtener imágenes de calcio, como se describe en los pasos 3.2 a 3.3. Complete la disección como se describe en Ishimoto y Sano, 2018. Con una micropipeta P-10, aspire cuidadosamente el cerebro diseccionado con cinco microlitros de solución de disección de la placa de Petri.

Expulsar lentamente el cerebro a la GLUture. Antes de que se seque la GLUture, oriente el cerebro en una posición dorsal hacia arriba con los dos lóbulos cerebrales hacia abajo y el cordón ventral dorsal hacia arriba. Con una micropipeta P-200, transfiera 100 microlitros de tampón de imágenes de calcio sobre el cerebro de las larvas inmovilizadas en el cubreobjetos.

Abra VisiView para obtener imágenes de calcio, utilizando el microscopio giratorio invertido Leica DMi8. Capture imágenes utilizando un 10X/1.4 cualquier objetivo con filtros, cambiando entre el láser GFP y el láser RFP. Los valores de exposición oscilan entre 100 y 1000 milisegundos y la ganancia se establece en el 50% del valor de exposición correspondiente.

Se aplica un factor de puja de dos durante la captura de la imagen. Identifique la neurona de interés buscando la señal tdTomato con el láser RFP. Una vez identificada la región de interés, cambie al láser GFP para capturar señales GCaMP6f.

Asegúrese de que las señales tdTomato y GCaMP coloquializan antes de capturar imágenes de pila de ambos canales. Capture dos grabaciones de series temporales separadas de las señales de éxito de tdTomato y GCaMP6f simultáneamente a una velocidad de 0,5 fotogramas por segundo, durante un total de dos minutos. Importe las pilas de señales tdTomato y GCaMP6f en ImageJ.

Para identificar la región de interés correcta, combine las señales tdTomato y GCaMP6f para confirmar la colocalización. Después de la verificación, divida los canales tdTomato y GCaMP6f. Importe las macros personalizadas basadas en ROI en ImageJ.

Seleccione la pila GCaMP6f y presione ejecutar para el análisis de calcio. La macro primero genera proyecciones de máxima intensidad, realiza la corrección de movimiento, utilizando el complemento stack reg, y aplica la corrección de blanqueo. La corrección del movimiento se llevó a cabo definiendo una amplia región rectangular de interés, como el lóbulo cerebral en cada fotograma.

El cuadro rectangular debe cubrir todo el ROI en todos los fotogramas para garantizar una corrección de movimiento precisa, al tiempo que conserva la forma local, espacial y de ROI en todos los fotogramas. Cada ROI, las macros calcularon uno, la intensidad en todos los cuadros, dos, la diferencia de fluctuación de referencia, como la diferencia entre los valores de intensidad máxima y mínima durante los primeros 10 cuadros, y tres, el cambio máximo de intensidad cuadro a cuadro, Delta F. Los ROI que muestran fluctuaciones de intensidad inferiores a 10 unidades fueron eliminados. El conjunto de datos final se organizó en cuatro columnas, una, tiempo y marcos, dos, condiciones de muestra hambrientas o alimentadas, tres ID de réplica, muestras individuales y cuatro, intensidad normalizada.

Valor de la norma F escalado de cero a uno. Finalmente, el análisis y la visualización de datos se realizaron en R, utilizando scripts de R personalizados. Los paquetes necesarios, incluidos ggplot2, dplyr y readr, se instalaron y actualizaron antes de ejecutar el análisis.

El resultado incluía mapas de calor que ilustraban la intensidad de calcio normalizada para los primeros 30 fotogramas, 60 fotogramas y todos los fotogramas en el registro de series temporales, y diagramas de caja para mostrar la mediana de las intensidades normalizadas. La importancia de la intensidad de calcio normalizada se evaluó mediante la prueba U de Mann-Whitney. La figura uno es un esquema para configuraciones de imágenes de calcio in vivo y ex vivo.

La muestra larvaria completa A, o muestra de cerebro larvario B, se fijó en una capa delgada de GLUture en azul sólido, se extendió dentro de un pozo de vaselina y se redondeó en un vidrio de cubierta de microscopio. Las muestras se sumergieron en tampón de imágenes de calcio, azul claro, y se colocaron para obtener imágenes en un microscopio confocal de disco giratorio invertido. Se capturaron series temporales de imágenes de fluorescencia de calcio de las muestras.

El esquema se preparó utilizando BioRender. La figura dos ilustra las imágenes de fluorescencia GCaMP6f. A, imágenes divididas que muestran fluorescencia en el canal de 488 nanómetros, GCaMP6f y verde, y el canal de 525 nanómetros, tdTomato en rojo.

La imagen combinada se muestra en el panel derecho. B, ejemplo de trazas de fluorescencia sin procesar a lo largo del tiempo para GCaMP6f en verde y tdTomato en rojo en LN clave. La fluctuación en la fluorescencia de GCaMP6f indica actividad de calcio, mientras que la señal estable tdTomato se utiliza como control para identificar LN clave.

C, imágenes de señal GCaMP6f representativas para paneles superiores in vivo y preparaciones de paneles inferiores ex vivo. Las muestras no hambrientas se muestran a la izquierda y las muestras hambrientas se muestran a la derecha. La figura tres muestra las mediciones de fluorescencia GCaMP6f.

A, el panel superior izquierdo muestra un mapa de calor que muestra la dinámica temporal promedio de las señales de calcio de los elementos clave de larvas no hambrientas, N = 5, y hambrientas, N = 5, en la preparación in vivo de larvas enteras. El diagrama de caja en el panel superior derecho compara la intensidad de la señal de calcio normalizada entre muestras no hambrientas en gris y hambrientas en muestras blancas en la preparación in vivo. Prueba U de Mann-Whitney, P es inferior a 0,001.

B, el panel inferior izquierdo muestra un mapa de calor que muestra la dinámica promedio a portal de las señales de calcio de Keystone LN de no hambrientos, N = 5 y N = 5 hambrientos en el cerebro diseccionado de preparación ex-vivo. El diagrama de caja en el panel inferior derecho compara la intensidad de la señal de calcio normalizada entre muestras no hambrientas, grises y blancas, hambrientas en la preparación ex vivo. La prueba B de U de Mann-Whitney es inferior a 0,001.

Para demostrar nuestro enfoque de imágenes de calcio larvario, lo aplicamos con éxito a preparaciones in vivo y ex vivo de las larvas de drosophila. En ambas preparaciones, observamos una mayor actividad de LN clave y muestras hambrientas en comparación con las muestras no hambrientas. Esta mayor actividad trapezoidal se observó claramente en los mapas de calor, que muestran representaciones temporales de las respuestas durante 60 segundos, y en diagramas de caja que representan los valores promedio de intensidad de la señal.

Estos resultados son consistentes con los estudios recientes que demuestran una mayor actividad de las neuronas olfativas en animales hambrientos. Como se demuestra en este video, el adhesivo tisular GLUture reduce significativamente los artefactos de movimiento en configuraciones in vivo y ex vivo. Este método también podría aplicarse para estudiar diferentes tipos de estímulos, por ejemplo, la aplicación externa de olores y la superfusión interna de neuromoduladores.