Preparación de muestras para espectrometría de masas unicelular Estudios metabolómicos: lavado, enfriamiento, secado y almacenamiento combinados de células

Hemos desarrollado protocolos para preservar la integridad de los metabolitos celulares para estudios de espectrometría de masas unicelular. Investigamos cómo las condiciones de lavado, enfriamiento y almacenamiento afectan los metabolitos celulares. Recientemente se han desarrollado nuevos métodos de preparación de muestras y técnicas de espectrometría de masas para avanzar en los estudios metabolómicos unicelulares para comprender mejor la heterogeneidad celular y los mecanismos de la enfermedad.

Los investigadores deben superar múltiples desafíos clave, incluida la cantidad limitada de muestras, la sensibilidad de detección reducida debido a la complejidad de la muestra y los metabolitos alterados debido a la preparación y el análisis de muestras. Demostramos técnicas integrales de preparación de muestras que pueden preservar los metabolitos celulares y la integridad celular para estudios metabolómicos de espectrometría de masas unicelular. Nuestros protocolos podrían ofrecer una forma sencilla y eficaz de preparación, almacenamiento y transporte de muestras para estudios metabolómicos unicelulares utilizando diferentes técnicas de espectrometría de masas.

Para comenzar, incube las células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono. Monitorizar la confluencia de las células diariamente y pasarlas cuando los cultivos alcancen el 80% de confluencia. Para pasar, aspire el medio del plato y enjuague una vez con cinco mililitros de PBS.

Incubar las células con dos mililitros de tripsina EDTA al 0,25% a 37 grados centígrados durante tres minutos para facilitar el desprendimiento celular. Neutralice la tripsina agregando ocho mililitros de medio completo precalentado y pipetee suavemente para dispersar las células. Transfiera un mililitro de la suspensión a nueve mililitros de medio fresco y completo para contar las células.

Para sembrar las células, dilúyalas a una concentración final de uno por 10 a la potencia de seis células por mililitro. Coloque cubreobjetos de vidrio individuales de 18 milímetros en los pocillos de una placa de 12 pocillos. Agregue dos mililitros de medio completo y 200 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo para lograr dos veces 10 a la potencia de cinco células por pocillo.

Incube las células durante la noche para permitir la adhesión. Para lavar las celdas, agregue dos mililitros de solución fría de formiato de amonio a cada pocillo de la placa de 12 pocillos. Luego, con unas pinzas estériles, levante suavemente cada cubreobjetos que contenga células de adherencia de su pocillo y colóquelo brevemente durante dos o tres segundos en un pocillo separado precargado con dos mililitros de solución fría de formiato de amonio al 0,9%.

Coloque cada cubreobjetos enjuagado con formiato de amonio con las celdas hacia arriba en una placa de Petri dentro de un recipiente de papel de aluminio. Vierta lentamente de 10 a 20 mililitros de nitrógeno líquido sobre los cubreobjetos para garantizar una cobertura completa. E inmediatamente incline la placa de Petri con pinzas para decantar el nitrógeno líquido restante.

Con guantes criogénicos y pinzas aislantes, coloque la placa de Petri que contiene la cubierta de enfriamiento de nitrógeno líquido en la cámara del concentrador de vacío. Procese las muestras utilizando la configuración de vacío estándar durante cinco a siete minutos hasta que el nitrógeno líquido visible se evapore y los cubreobjetos parezcan secos. Asegúrese de que los cubreobjetos secos no contengan nitrógeno líquido residual ni cristales de hielo.

A continuación, envuelva el recipiente con una toalla de papel y transfiéralo a un congelador a 80 grados centígrados durante 48 horas. Después del almacenamiento, transfiera las hojas de cubierta que contienen la placa de Petri a un desecado a temperatura ambiente durante 10 minutos. Asegúrese de que la escarcha condensada o el agua en los resbalones de la cubierta desaparezcan por completo antes de retirarlos del desecador.

Divida las muestras en dos grupos y trátelas adecuadamente. Ahora, monte la sonda única en la platina XYZ y fíjela a un manipulador XYZ motorizado colocado debajo de un microscopio digital. Acople la configuración de una sola sonda a un espectrómetro de masas para el análisis SCMS.

Utilice acetona nitrilo que contenga ácido fórmico al 0,1% con una pureza de al menos el 99,9% como disolvente de extracción y suministre a un caudal de 150 nanolitros por minuto utilizando una bomba de jeringa. Establezca los parámetros de espectrometría de masas para los modos de iones positivos y negativos. Ahora, coloque los dos cubreobjetos del grupo uno y el grupo dos juntos en la platina XYZ motorizada de la configuración SCMS de una sola sonda y use el microscopio para seleccionar aleatoriamente las células para el análisis.

Después de adquirir espectros de masas, analice aproximadamente 30 celdas por grupo utilizando la misma sonda única, caudal de disolvente y voltaje de ionización. Preprocese los datos SCMS sin procesar utilizando un script R personalizado y aplique la eliminación de ruido y fondo seguida de la normalización de la intensidad de iones a la corriente de iones total. Desisótopo de los datos SCMS utilizando el isótopo MSD del paquete de Python.

Realizar la alineación de picos mediante un script de Python interno. Aplique un ancho de contenedor de 0,01 relación de carga maestra para la agrupación y una tolerancia de masa de 0,01 relación de carga maestra o cinco partes por millón para la alineación de picos. Realice análisis de datos estadísticos utilizando Metabo Analyst 6.0.

Realice una prueba T y genere un mapa de calor que muestre los niveles relativos de metabolitos. Seleccione la opción utilizada top 100 y T-test o Inova para generar los 100 metabolitos principales clasificados por importancia y trace un mapa de calor utilizando estos 100 metabolitos principales con diferencias significativas. Finalmente, busque los valores precisos de carga maestra en la base de datos de metabolomas humanos utilizando una tolerancia de masa de 10 partes por millón para la búsqueda en la base de datos.

El análisis de componentes principales en el modo de iones positivos mostró que el grupo uno y el grupo dos se superponían estrechamente, lo que indica perfiles de metabolitos muy similares. En el modo de iones negativos, se observó un patrón comparable, aunque el grupo dos parecía ligeramente más distinto. El análisis del mapa de calor de los 100 metabolitos principales mostró patrones de abundancia altamente consistentes entre el grupo uno y el grupo dos en ambos modos de iones.

No se observan cambios importantes ni agrupaciones específicas del grupo. Aunque las variaciones menores en algunos grupos de metabolitos pueden reflejar diferencias en la eficiencia de ionización o la estabilidad de los metabolitos.