Inducción de precisión y distinción de los reflejos de tos y estornudo en ratones

Este protocolo se centra en el reflejo respiratorio en ratones. Nuestro objetivo es estimular la tráquea y la cavidad nasal para inducir tos y estornudos, y diferenciaremos entre estos dos tipos de eventos en función de las características de audio. Estudios previos solían utilizar capsaicina nebulizada o ácido cítrico para estimular el control respiratorio y los comportamientos de tos y estornudos en ratones.

Sin embargo, sigue sin estar claro si la estimulación respiratoria por nebulización induce tos, estornudos o ambas cosas, ya que actualmente no existe un método fiable para distinguir estas dos respuestas. Para este proyecto, establecimos un método para inducir la tos y los estornudos estimulando selectivamente la tráquea o la cavidad nasal. También utilizamos análisis acústicos para identificar las características distintivas entre la tos y el estornudo.

Nuestra investigación en conjunto proporciona una herramienta poderosa que apoyará directamente el desarrollo de futuros fármacos para los trastornos de tos y estornudos. Para empezar, corta una aguja de calibre 28 en una cánula de aproximadamente cinco milímetros de longitud. Usando pinzas y papel abrasivo, alisa ambos extremos y une uno a un tubo de silicona.

Conecta la cánula unida a tubo a una jeringuilla de un mililitro y enjuaga la cánula con agua para verificar la patencia. A continuación, dobla la cánula en un ángulo de 90 grados con una relación de dos a tres brazos. Inserta el brazo más largo en el tubo de silicona de cinco centímetros de largo.

Asigna aleatoriamente a los ratones a tres grupos, con seis ratones cada uno. Ahora, asegura al ratón anestesiado en posición supina sobre la camilla. Después de afeitar el vello craneal y cervical, desinfecta la zona con iodóforo y alcohol.

Bajo el microscopio, incisa la piel cervical aproximadamente un centímetro y disecciona de forma directa tejidos y músculos para exponer la tráquea. Perfora el tejido blando entre los cartílagos cricoides y traqueales con una aguja calibre 32. Luego, crea una abertura tráqueal mínima con tijeras oftálmicas.

Inserta la cánula metálica recubierta de silicona aproximadamente un milímetro en el lumen traqueal y asegura la unión cánula-tráquea con una sutura 7-0. Ahora, incide el cuero cabelludo aproximadamente un centímetro y haz un túnel subcutáneo de forma directa desde el cuello hasta el cráneo. Pasar el tubo de silicona por el túnel subcutáneo hasta el cráneo, fijarlo al cráneo con cemento dental y luego coser la piel.

Sutura la incisión cervical y deja que el animal se recupere durante cinco días. Instala la sonda ultrasónica con un anillo de sellado compatible con puerto e inserta la sonda en el puerto de la cámara de pletismografía de todo el cuerpo para asegurar un contacto hermético. Conecta la cámara de pletismografía de cuerpo completo al sensor de flujo y al sistema de flujo polarizado.

Coloca un tubo de silicona fijado al cráneo a un tubo de extensión de 30 centímetros y coloca el ratón en la cámara de pletismografía de todo el cuerpo. Extiende el tubo por el puerto superior de la cámara y sella el puerto con arcilla para modelar alrededor del tubo. Verifica la hermandad al aire confirmando que los picos de la forma de onda respiratoria están dentro de cuatro, más o menos dos.

Conecta una jeringuilla de un mililitro cargada con cinco mililitros de solución de capsaicina al tubo de extensión y móntala en la bomba de microinyección. Coloca una cámara de alta velocidad orientada hacia la recámara. Ajusta la distancia y el enfoque de la cámara para una vista clara, y pon la frecuencia de muestreo a 160 fotogramas por segundo.

Ahora, simultáneamente, inicia la pletismografía de todo el cuerpo, la ecografía y el software de la cámara. Activa la bomba para iniciar la infusión de capsaicina y registra los conteos de tos durante 10 minutos. Prepara a los animales y todos los materiales necesarios para el procedimiento.

Después de anestesiar y preparar el ratón, sujétalo en un marco estereotáxico. Desinfecta la zona quirúrgica con iodóforo y alcohol. Incisa la piel sobre el cráneo y el hueso nasal, usando un bisturí para exponer el hueso nasal.

Con un microtaladro, crea un agujero de 0,5 milímetros en la unión entre el hueso nasal y el proceso lateral del cartílago nasal. Ahora, expone la mucosa nasal a través del orificio de la muela. Levanta suavemente la mucosa nasal con una aguja de calibre 32 para exponer la cavidad nasal.

Luego, monta el tubo de polietileno en el brazo estereotáxico. Alinea la punta del tubo al ras de la abertura del orificio de la muebla, fija el tubo al hueso nasal usando cemento dental y luego cose la piel. Coloca el ratón sobre una almohadilla térmica y déjalo recuperarse hasta que recupere la conciencia.

Conecta la cámara de pletismografía de cuerpo completo al sensor de flujo y al sistema de flujo de polarización según el manual del fabricante. A continuación, instala la sonda ultrasónica con una junta adaptada al puerto. Introduce la sonda en la cámara de pletismografía y verifica que el sello sea hermético.

Transfiere el ratón a la cámara de pletismografía y extiende el tubo de polietileno por el puerto superior. Sella el puerto con plastilina para asegurar el tubo. Verifica la hermeticidad de la cámara y monta la cámara como se ha demostrado antes.

Finalmente, avanza un filamento de nailon de 0,25 milímetros de diámetro a través de un tubo blando hasta la cavidad nasal hasta una profundidad de cero a tres milímetros. Deja cinco centímetros del filamento expuestos más allá del tubo portátil. Durante cada estimulación, presiona el extremo libre del filamento hasta que se doble aproximadamente 45 grados, aplicando alrededor de 0,6 gramos de fuerza a la mucosa nasal durante un segundo.

Repite la estimulación una vez cada 30 segundos mientras grabas las respuestas de estornudo durante 10 minutos. Los ratones sometidos a cirugía traqueal o nasal con estimulación nasale mecánica y desafío traqueal con capsaicina aumentaron significativamente los eventos de estornudos y tos, respectivamente. Los registros de pletismografía de cuerpo entero mostraron trazas respiratorias tanto de pico simple como doble para tos inducida por capsaicina y estornudos inducidos mecánicamente.

Los oscilogramas sonoros revelaron que el audio de tos tenía una intensidad máxima de inicio abrupto, concentrándose en el rango de cero a 30 kilohercios. Mientras que el audio de estornudos fue aumentando progresivamente en intensidad, abarcó un rango de cero a 80 kilohercios y tuvo una duración más larga. La fase de compresión de las tos de pico único fue de alrededor de 32,39 milisegundos, significativamente más corta que las toses de pico doble, con una duración de unos 53,17 milisegundos.

La fase media de compresión de los estornudos de pico único fue de unos 44,03 milisegundos, mientras que los de pico doble promediaron unos 74,24 milisegundos y fueron significativamente más largos. Los patrones de pico único se produjeron en el 77,55% de las toses, mientras que solo el 32,42% de los estornudos presentaron picos únicos, con patrones de doble pico dominando en un 67,58%. Las duraciones de audio de los estornudos fueron significativamente más largas que las duraciones de tos, aunque con rangos superpuestos. La transección de aferentes sensoriales nasales redujo significativamente los estornudos inducidos por capsaicina, mientras que la tos permaneció intacta.