Name: Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende el ensayo de co-sedimentación de actina para analizar proteínas que se unen a la F-actina in vitro. Este método permite estudiar interacciones proteicas en el citoesqueleto de células.

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Gracias al Dr. Praveen Kumar en el laboratorio de Wittman en la UCSF para la película de la actina en células HaCaT.

1. Preparación de la actina La fuente de la actina utilizada en este ensayo no era muscular plaquetas humanas (β-actina) obtenidos a partir del citoesqueleto Inc. alícuotas de archivo de 10 mg / ml se mantienen en el congelador -70 º C. Para el ensayo, la actina se diluye a 0,4 mg / ml en un tampón que contenía 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM ATP y 0,5 mM de TDT, se centrifuga a 20.000 g durante 10 minutos a 4 º C. El sobrenadante, que es la actina monomérica está listo para ser polimerizado. Polimerización de la actina es inducida por la adición de KCl 50 mM, 1 mM ATP y 2 mM de MgCl 2. La polimerización se produce a temperatura ambiente durante 1 hora. 2. Preparación de la proteína En este ensayo, se utiliza el C-terminal de Tallin, que se ha purificado como una proteína GST-etiquetados. La proteína que se utiliza en el ensayo se somete a una centrifugación de alta velocidad para pre-clara de los agregados antes de la incubación con F-actina. La proteína se hace girar a 100.000 g en una ultracentrífuga Beckman durante 20 minutos a 22 º C. 3. Actina-proteína de incubación La cantidad de actina y las proteínas en un ensayo puede variar. En este ejemplo estamos utilizando actina en exceso. Normalmente, una relación molar se calcula, por ejemplo. una relación de 4:1 molar de actina a la proteína. En el siguiente ensayo, el volumen final de reacción es de 150 l. Búfer en el que se incuban las proteínas y F-actina dependerá de la proteína a ser probado y en las condiciones requeridas. En este ejemplo, se utiliza un tampón que contiene 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2 y 2 mM de MgCl 2. La proteína y el F-actina se incuban en el buffer durante 1 hora a temperatura ambiente. 4. La sedimentación de la F-actina Después de la incubación, las muestras se centrifugaron a 100.000 g a 22 º C. Utilizamos una ultracentrífuga Beckman en el video. El rotor se retira cuidadosamente para no molestar a los pellets. 5. El análisis de proteínas co-sedimentación con F-actina Los sobrenadantes se retira cuidadosamente con la pipeta en un tubo eppendorf y 5 X Laemmli SDS-PAGE muestra de amortiguación, se añade. Un volumen adecuado de 1 x tampón de muestra Laemmli SDS-PAGE se añade al resto de pellets, una pipeta de arriba a abajo, y trasladado a nuevos tubos eppendorf. Las cantidades relativas de proteína en los sedimentos y sobrenadantes son analizados después de su separación por SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie del gel o Western Blot. Con el fin de determinar la especificidad de la interacción con la proteína actina, la actina dependiente de la concentración de co-sedimentación se puede realizar. Para este tipo de experimento, una cantidad fija de la proteína y una serie de cantidades cada vez mayores de la actina se incuban, y el análisis se lleva a cabo como se describió anteriormente.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

Actina co-sedimentación es un simple ensayo in vitro para analizar las proteínas de unión a specfic F-actina. En este vídeo, que muestran un ejemplo de cómo un sencillo actina co-sedimentación puede llevarse a cabo. Se muestra cómo preparar la F-actina, preparar la proteína a ser probado y el procedimiento de la actina co-sedimentación. Una serie de puntos deben ser considerados en el ejercicio de actina sedimentación co-ensayos. Por ejemplo, los componentes del tampón de incubación puede variar en función de la proteína a ser probado y el ...

actina co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la f-actina

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

El citoesqueleto de actina en la célula es una red de filamentos de actina que permite el movimiento de las células y los procesos celulares, y que genera tensión y ayuda a mantener la forma celular. Aunque el citoesqueleto de actina es una estructura rígida, es una estructura dinámica que está en constante remodelación. Una serie de proteínas se puede unir al citoesqueleto de actina. La unión de una proteína en particular a la F-actina se desea a menudo para apoyar la célula observaciones biológicas o para comprender mejor los procesos dinámicos debido a la remodelación del citoesqueleto de actina. La actina co-sedimentación ensayo es un ensayo in vitro utilizan habitualmente para analizar la unión de proteínas específicas o dominios de la proteína con la F-actina. Los principios básicos de la prueba implica un período de incubación de la proteína de interés (de larga duración o el dominio de), con F-actina, paso ultracentrifugación para precipitar la F-actina y el análisis de la proteína co-sedimentación con F-actina. Actina sedimentación co-ensayos pueden ser diseñados para medir la afinidad de unión de actina y en los ensayos de la competencia.

Proteínas se unen a la actina filamentosa (F-actina) a través de módulos de unión de actina distintas. En este video se demuestra el procedimiento de la actina co-sedimentación, que es un ensayo in vitro utilizan habitualmente para analizar las proteínas o dominios específicos que se unen a la F-actina.

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

El citoesqueleto de actina dentro de la célula es una red de filamentos de actina que permite el movimiento de las células y los procesos celulares, y que genera ...

En la célula, el citoesqueleto de actina es una estructura dinámica, y su remodelación es importante en diversos procesos, desde la división celular, la migración celular y el transporte físico. Una gran variedad de proteínas pueden unirse al citoesqueleto de actina mediante módulos específicos de unión a la actina.En este video, demostramos el procedimiento de co-sedimentación con actina, un ensayo in vitro que se utiliza rutinariamente para analizar proteínas o dominios específicos de proteínas que se unen a la actina filamentosa. Hola, soy Jody Var del laboratorio de la Dra. Diane Barber en el Departamento de Biología Celular y de Tejidos de la UCSF. En este video, les mostraré un procedimiento para realizar un ensayo de co-sedimentación con actina.Este procedimiento es un método para analizar proteínas que se unen específicamente a la actina filamentosa y puede utilizarse para medir afinidades de unión. Este procedimiento incluye los siguientes pasos: formación de filamentos de actina y preparación de la proteína que se va a probar, incubación de la proteína de interés con actina filamentosa, o f-actina por abreviar, sedimentación de la f-actina mediante ultracentrifugación a cien mil G, electroforesis en gel SDS-PAGE y tinción con Coomassie para visualizar las fracciones del sobrenadante y del sedimento.Y finalmente, el análisis de la proteína que co-sedimenta con el f-actina en la fracción de paleta. Comencemos. Para preparar los filamentos de actina, es una buena práctica asegurarse de que la actina con la que estamos trabajando se encuentre en forma monomérica.Una solución stock de actina a 10 M por mil se retira del congelador a menos 80 y se prepara una dilución de trabajo a 2,4 mg por mil en un tampón que contiene tris cloruro de calcio, ATP para la estabilización del monómero y DTT. La dilución de trabajo se coloca en hielo durante una hora tras una incubación de una hora en hielo. La solución de actina se centrifuga a 14.000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados.El sobrenadante resultante será la actina monomérica. Ahora, a partir de estos monómeros de actina purificados, se puede generar actina filamentosa mediante la adición de cloruro de potasio, cloruro de magnesio y ATP durante una hora. A temperatura ambiente, la actina filamentosa ya está lista para incubarla con la proteína o dominio proteico de interés, lo cual les mostraremos en el siguiente paso.Para continuar con el ensayo de co-sedimentación de actina, debemos preparar la proteína que se va a probar. Hoy estoy utilizando el clan, que ha sido purificado como una proteína de fusión GSC. La proteína se pre-limpia de agregados mediante ultracentrifugación y el sobrenadante resultante ya está listo para usar en el ensayo.Para probar la unión de proteínas a la actina, la actina debe estar en exceso. En este caso, 10 microgramos de actina se incuban con cinco microgramos de proteína en un tampón que contiene tris, A TP BT ME capto etanol ETTA cloruro de calcio, para obtener un volumen total de 150 microlitros para la incubación de la proteína con actina. Las incubaciones se llevan a cabo directamente en tubos de ultracentrífuga durante una hora a temperatura ambiente. Los tubos uno y dos representan los controles. El tubo uno contiene solo actina en tampón.El dos contiene solo proteína en el tubo de tampón. El tres contiene tanto actina como la CNU de talina en el tampón dos. El cuatro es un control adicional para la unión no específica, que contiene actina y la proteína GST por separado. Después de la incubación de una hora, nuestras muestras se colocan cuidadosamente en el rotor Beckman.A continuación, ajustamos el ultracentrífugo a cien mil G y corrimos las muestras durante 20 minutos a 22 grados C. Tras esta centrifugación, pudimos preparar nuestras muestras para su electroforesis en SDS-PAGE. Después de la centrifugación de 20 minutos, las muestras se retiran cuidadosamente del rotor para que el precipitado no se perturbe. Se hace una marca en el lado del tubo donde se encuentra el precipitado.Se tiene cuidado al transferir el sobrenadante a tubos eppendorf a los cuales se añade tampón de muestra XSCS 5X. Se añade tampón de muestra XSCS 1X al precipitado que queda en los tubos de ultracentrífuga. Después de pipetear hacia arriba y hacia abajo, el precipitado en suspensión se transfiere a un tubo eppendorf nuevo.A continuación, las muestras se hierven en un bloque calefactor durante hasta 10 minutos. Después de hervir, las muestras se cargan en un gel de electroforesis SDS-PAGE. Aquí estoy utilizando un gel del 10 % ya preparado.Las muestras se cargan cuidadosamente en los pozos en el orden correcto. El gel se realiza a voltios constantes durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. Una vez finalizada la electroforesis, se tiñe con azul de Coomassie para visualizar las proteínas.Las soluciones azules Kumasi deben cubrir completamente el gel. Se deja el gel en un agitador durante al menos 20 minutos. Luego se retira la solución azul ESI y se sumerge el gel en la solución reveladora.El gel se deja reposar durante aproximadamente una hora en un agitador hasta que se observen bandas en el gel. Después de la tinción con kumasi, el gel puede analizarse para determinar la cantidad relativa de proteína en las fracciones de sobrenadante frente a las de precipitado. Al observar el gel que se recuperó en las bandas uno y dos, podemos ver las fracciones de sobrenadante y precipitado de actina solamente.En los carriles tres y cuatro, teníamos las fracciones de sobrenadante y pellet de la cola de C teer sola. En los carriles cinco y seis, teníamos las fracciones de sobrenadante y pellet de la actina y C de cola y la incubación. En los carriles siete y ocho, teníamos las fracciones de sobrenadante y pellet de la incubación de actina y la proteína GST.Como puede observarse, el CT de la cola solo es visible en la fracción del paladar en la banda seis. Los resultados de este gel indican una unión específica del extremo C, la cola, con la actina. En este video, ha observado cómo realizar un ensayo de co-sedimentación con actina.Los ensayos de sedimentación de actina son un método in vitro para analizar proteínas que se unen a la actina. Al realizar este procedimiento, es importante recordar estos puntos: preclear la proteína de interés e incluir un control negativo de la proteína sola para cada incubación de proteína con actina.Este control mostrará si alguna de las proteínas preclarificadas se sedimenta por sí sola, ya que la unión a la f-actina por parte de algunas proteínas puede ser sensible al pH, a la temperatura o a la concentración de sal en el tampón. Eso es todo. Gracias por verlo y buena suerte con sus experimentos.

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Aprende el ensayo de co-sedimentación de actina para analizar proteínas que se unen a la F-actina in vitro. Este método permite estudiar interacciones proteicas en el citoesqueleto de células.

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

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