Name: Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende el ensayo de co-sedimentación de actina para analizar proteínas que se unen a la F-actina in vitro. Este método permite estudiar interacciones proteicas en el citoesqueleto de células.

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Gracias al Dr. Praveen Kumar en el laboratorio de Wittman en la UCSF para la película de la actina en células HaCaT.

1. Preparación de la actina La fuente de la actina utilizada en este ensayo no era muscular plaquetas humanas (β-actina) obtenidos a partir del citoesqueleto Inc. alícuotas de archivo de 10 mg / ml se mantienen en el congelador -70 º C. Para el ensayo, la actina se diluye a 0,4 mg / ml en un tampón que contenía 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM ATP y 0,5 mM de TDT, se centrifuga a 20.000 g durante 10 minutos a 4 º C. El sobrenadante, que es la actina monomérica está listo para ser polimerizado. Polimerización de la actina es inducida por la adición de KCl 50 mM, 1 mM ATP y 2 mM de MgCl 2. La polimerización se produce a temperatura ambiente durante 1 hora. 2. Preparación de la proteína En este ensayo, se utiliza el C-terminal de Tallin, que se ha purificado como una proteína GST-etiquetados. La proteína que se utiliza en el ensayo se somete a una centrifugación de alta velocidad para pre-clara de los agregados antes de la incubación con F-actina. La proteína se hace girar a 100.000 g en una ultracentrífuga Beckman durante 20 minutos a 22 º C. 3. Actina-proteína de incubación La cantidad de actina y las proteínas en un ensayo puede variar. En este ejemplo estamos utilizando actina en exceso. Normalmente, una relación molar se calcula, por ejemplo. una relación de 4:1 molar de actina a la proteína. En el siguiente ensayo, el volumen final de reacción es de 150 l. Búfer en el que se incuban las proteínas y F-actina dependerá de la proteína a ser probado y en las condiciones requeridas. En este ejemplo, se utiliza un tampón que contiene 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2 y 2 mM de MgCl 2. La proteína y el F-actina se incuban en el buffer durante 1 hora a temperatura ambiente. 4. La sedimentación de la F-actina Después de la incubación, las muestras se centrifugaron a 100.000 g a 22 º C. Utilizamos una ultracentrífuga Beckman en el video. El rotor se retira cuidadosamente para no molestar a los pellets. 5. El análisis de proteínas co-sedimentación con F-actina Los sobrenadantes se retira cuidadosamente con la pipeta en un tubo eppendorf y 5 X Laemmli SDS-PAGE muestra de amortiguación, se añade. Un volumen adecuado de 1 x tampón de muestra Laemmli SDS-PAGE se añade al resto de pellets, una pipeta de arriba a abajo, y trasladado a nuevos tubos eppendorf. Las cantidades relativas de proteína en los sedimentos y sobrenadantes son analizados después de su separación por SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie del gel o Western Blot. Con el fin de determinar la especificidad de la interacción con la proteína actina, la actina dependiente de la concentración de co-sedimentación se puede realizar. Para este tipo de experimento, una cantidad fija de la proteína y una serie de cantidades cada vez mayores de la actina se incuban, y el análisis se lleva a cabo como se describió anteriormente.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

Actina co-sedimentación es un simple ensayo in vitro para analizar las proteínas de unión a specfic F-actina. En este vídeo, que muestran un ejemplo de cómo un sencillo actina co-sedimentación puede llevarse a cabo. Se muestra cómo preparar la F-actina, preparar la proteína a ser probado y el procedimiento de la actina co-sedimentación. Una serie de puntos deben ser considerados en el ejercicio de actina sedimentación co-ensayos. Por ejemplo, los componentes del tampón de incubación puede variar en función de la proteína a ser probado y el ...

actina co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la f-actina

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

El citoesqueleto de actina en la célula es una red de filamentos de actina que permite el movimiento de las células y los procesos celulares, y que genera tensión y ayuda a mantener la forma celular. Aunque el citoesqueleto de actina es una estructura rígida, es una estructura dinámica que está en constante remodelación. Una serie de proteínas se puede unir al citoesqueleto de actina. La unión de una proteína en particular a la F-actina se desea a menudo para apoyar la célula observaciones biológicas o para comprender mejor los procesos dinámicos debido a la remodelación del citoesqueleto de actina. La actina co-sedimentación ensayo es un ensayo in vitro utilizan habitualmente para analizar la unión de proteínas específicas o dominios de la proteína con la F-actina. Los principios básicos de la prueba implica un período de incubación de la proteína de interés (de larga duración o el dominio de), con F-actina, paso ultracentrifugación para precipitar la F-actina y el análisis de la proteína co-sedimentación con F-actina. Actina sedimentación co-ensayos pueden ser diseñados para medir la afinidad de unión de actina y en los ensayos de la competencia.

Proteínas se unen a la actina filamentosa (F-actina) a través de módulos de unión de actina distintas. En este video se demuestra el procedimiento de la actina co-sedimentación, que es un ensayo in vitro utilizan habitualmente para analizar las proteínas o dominios específicos que se unen a la F-actina.

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

El citoesqueleto de actina dentro de la célula es una red de filamentos de actina que permite el movimiento de las células y los procesos celulares, y que genera ...

En la célula, el citoesqueleto de actina es una estructura dinámica, y su remodelación es importante en diversos procesos, desde la división celular, la migración celular y el transporte físico. Una gran variedad de proteínas pueden unirse al citoesqueleto de actina mediante módulos específicos de unión a la actina.En este video, demostramos el procedimiento de co-sedimentación con actina, un ensayo in vitro que se utiliza rutinariamente para analizar proteínas o dominios específicos de proteínas que se unen a la actina filamentosa. Hola, soy Jody Var del laboratorio de la Dra. Diane Barber en el Departamento de Biología Celular y de Tejidos de la UCSF. En este video, les mostraré un procedimiento para realizar un ensayo de co-sedimentación con actina.Este procedimiento es un método para analizar proteínas que se unen específicamente a la actina filamentosa y puede utilizarse para medir afinidades de unión. Este procedimiento incluye los siguientes pasos: formación de filamentos de actina y preparación de la proteína que se va a probar, incubación de la proteína de interés con actina filamentosa, o f-actina por abreviar, sedimentación de la f-actina mediante ultracentrifugación a c

actin-co-sedimentation-assay-for-analysis-protein-binding-to-f

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Investigación

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Biología

Nosotros aplicamos la etiqueta sin análisis de la interacción de proteínas utilizando Biacore X100 para el análisis de estructura-función de la unión de varios mutantes cistatina B a la papaína través de la caracterización cinética. Libre de calibración de análisis de concentración (ACCP) mide la concentración de proteína con actividad de unión retenido sin la necesidad de una curva patrón. Nos muestran que la confirmación de las concentraciones de uso de la ACCP aumenta la fiabilidad de los...

La importancia de la concentración de la proteína correcta para la cinética y la determinación de afinidad en el análisis de la estructura-función

La polimerización de FtsZ es esencial para la división celular bacteriana. En este informe, detallamos protocolos simples para monitorear la actividad de polimerización de FtsZ y discutimos la influencia de la composición del tampón. Los protocolos se pueden utilizar para estudiar la interacción de FtsZ con proteínas reguladoras o fármacos antibacterianos que afectan a la polimerización de FtsZ.

FtsZ Polimerización Ensayos: Protocolos simples y Consideraciones

Este protocolo describe un método para probar la capacidad de una proteína para co-sedimentar con actina filamentosa (F-actina) y, si se observa unión, para medir la afinidad de la interacción.

Medición de la unión de proteínas a actina F por co-sedimentación

Primeras funciones de endosome dependen de polimerización de la actina F. Aquí, describimos un análisis basado en la microscopía en vitro que reconstituye la nucleación y polimerización de la actina F en membranas de endosomal temprana en tubos de ensayo, por lo que esta serie compleja de reacciones susceptibles de Bioquímica y genética manipulaciones.

In Vitro Polimerización de la F-actina en endosomas tempranos

Divulgamos un ensayo simple, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento basado en espectroscopia de fluorescencia para la cuantificación de filamentos de actina en muestras biológicas ex vivo de tejidos cerebrales de roedores y sujetos humanos.

Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

Para avanzar, los conos de crecimiento deben ejercer fuerzas de tracción contra el entorno externo. La generación de fuerzas de tracción depende de la dinámica de la actina y el acoplamiento del embrague. El presente estudio describe métodos para analizar la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y las fuerzas de tracción para el avance del cono de crecimiento.

Análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento

Presentamos protocolos para ensayos microfluídicos de filamentos de actina simples, en combinación con microscopía de fluorescencia, que permiten monitorear con precisión filamentos de actina individuales en tiempo real mientras se exponen secuencialmente a diferentes soluciones de proteínas.

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

Este protocolo describe la formación de bicapas lipídicas soportadas y la adición de filamentos citoesqueléticos y proteínas motoras para estudiar la dinámica de las redes citoesqueléticas reconstituidas y atadas a la membrana utilizando microscopía de fluorescencia.

Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

Este protocolo describe cómo producir cometas de actina en las superficies de las perlas utilizando ingredientes proteicos disponibles comercialmente. Tales sistemas imitan las estructuras protrusivas que se encuentran en las células, y se pueden utilizar para examinar los mecanismos fisiológicos de la producción de fuerza de una manera simplificada.

Reconstitución de la motilidad basada en actina con proteínas disponibles comercialmente

Este método describe un ensayo de sedimentación in vitro basado en lectinas para cuantificar la afinidad de unión de la glucano fosfatasa y la amilopectina. Este ensayo de cosedimentación es confiable para medir la unión del sustrato de glucano fosfatasa y se puede aplicar a varios sustratos de glucano solubilizados.

Ensayo de sedimentación basado en concanavalina A para medir la unión al sustrato de las fosfatasas de glucano

Aprende el ensayo de co-sedimentación de actina para analizar proteínas que se unen a la F-actina in vitro. Este método permite estudiar interacciones proteicas en el citoesqueleto de células.

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

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