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Me gustaría agradecer el apoyo del Departamento de Biotecnología (DBT), el Consejo Indio de Investigación Médica (ICMR) y la Junta de Investigación en Ciencias e Ingeniería (SERB).

Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Cultivo de Mycobacterium
<ol>
	<li>Inocular 1 mL del stock de glicerol de Msmeg o Mtb en 10 mL de medio Middlebrook 7H9 suplementado con 0,2% de glicerol, 0,05% de Tween 80 y 10% de ADC a 37 °C con agitación a 150 rpm hasta que la DO alcance 1–1,5.</li>
	<li>Crecer la cultura secundaria añadiendo 1% de la cultura primaria en 10 mL de medio 7H9 hasta la fase logarítmica media, con una DO600nm = 0,6–0,7.</li>
	<li>Dividir en alícuotas de 3 mL y centrifugar los cultivos a 2000 x g durante 5 min a temperatura ambiente (23–25 °C).</li>
	<li>Almacenar los pellets a -80 °C hasta la extracción de ARN. 
	ADVERTENCIA: Para cultivos de Mtb, seguir las pautas adecuadas de BSL3 e inactivar por calor el pellet a 95 ˚C durante 20–25 min. 
	NOTA: Figura 1 muestra el diagrama de flujo de los pasos básicos seguidos durante la extracción de ARN mediante el método de fenol caliente.</li>
</ol>
<img alt="Diagrama de extracción de ARN con fenol caliente; el flujo de trabajo muestra centrifugación, separación de fases y análisis de integridad del ARN." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig1.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Representación esquemática del método de fenol caliente y su análisis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Extracción de ARN
<ol>
	<li>Método del fenol caliente (método HP)
	<ol>
		<li>Añada 200 µL de tampón TES (100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 5 mM EDTA, pH 8.0; 0.1 M NaCl; % SDS; 1% β-mercaptoetanol) al precipitado celular y resuspenda el precipitado mediante vortex. </li>
		<li>Añada aproximadamente 0,1 g de perlas de sílice de 0,1 mm a la muestra. Utilice un homogeneizador manual de tejidos durante 10–15 s hasta que el precipitado se haya descongelado completamente en hielo. Repita este paso durante 2 ciclos más, seguido de congelación rápida en nitrógeno líquido tras cada repetición. </li>
		<li>O BIEN utilice un ruptor de perlas de alta velocidad de banco durante 1 min a una velocidad de 5 (5,0 m/s) a temperatura ambiente. Repita este paso durante 3 ciclos e incube la muestra en hielo para evitar el calentamiento tras cada ciclo. 
		NOTA: Repita la lisis de células de Mtb durante 6–8 ciclos (cada ciclo de 1 min) con un homogeneizador manual de tejidos o un ruptor de perlas, y enfríe intermitentemente en hielo tras cada ciclo. Utilice agua tratada con DEPC (diethylpirocarbonato) para la preparación de todos los tampones y reactivos necesarios para la extracción de ARN. </li>
		<li>Añada 200 µL adicionales de tampón TES (precalentado a 65 °C) a cada muestra para alcanzar un volumen total de 400 µL. A cada muestra, añada 200 µL de fenol ácido (fenol equilibrado con tampón citrato 100 mM, pH 4,5) y 200 µL de cloroformo (mezcle el fenol ácido y el cloroformo en una proporción 1:1 antes de añadirlo a la muestra). </li>
		<li>Incube la muestra a 65 °C en un bloque térmico con agitación a 900 rpm durante 30 min y centrifugue a 12000 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Asegúrese de una correcta separación de fases tras la centrifugación (se observará una fase acuosa superior clara que contiene ARN, una interfase definida de ADN y una fase orgánica inferior que contiene proteínas y lípidos). </li>
		<li>Retire la capa superior de la fase acuosa y transfiérala a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mL. Añada nuevamente un volumen igual de fenol ácido:cloroformo. Centrifugue a 12000 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Asegúrese de una correcta separación de fases. </li>
		<li>Transfiera la capa acuosa superior a un tubo microcentrífugo nuevo de 1,5 mL, luego añada 30 µL de tampón de acetato de sodio 3 M, pH 5,3, y 240 µL de isopropanol frío. Incube a −80 °C durante 30 min a 1 h. 
		NOTA: El tubo microcentrífugo puede almacenarse durante la noche a -80 °C en este paso. Selle el tubo microcentrífugo con varias capas de parafilm para evitar que se abra a 65 °C durante la incubación. 
		ADVERTENCIA: El fenol y el cloroformo son sustancias químicas peligrosas; por lo tanto, deben seguirse los procedimientos adecuados de protección personal (EPP), controles de ingeniería como campanas extractoras y procedimientos específicos de eliminación de residuos. </li>
		<li>Centrifugue a 12000 x g durante 1 h a temperatura ambiente. Asegúrese de la formación del precipitado y retire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado. </li>
		<li>Resuspenda el precipitado en 1 mL de etanol al 75% y centrifugue a 12000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Realice este paso dos veces y seque el precipitado al aire. </li>
		<li>Resuspenda el precipitado en 50 µL de agua libre de nucleasas. 
		​NOTA: Para disolver el ARN, incúbelo en agua libre de RNasas durante 10–30 min a temperatura ambiente. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Método con TRIzol
	<ol>
		<li>Añada 200 µL de reactivo TRIzol al precipitado celular. 
		ADVERTENCIA: El TRIzol es una sustancia química peligrosa; por lo tanto, deben seguirse los procedimientos adecuados de protección personal (EPP), controles de ingeniería como campanas extractoras y procedimientos específicos de eliminación de residuos. </li>
		<li>Siga el método de lisis celular descrito en los pasos 2.1.2 - 2.1.3. </li>
		<li>Añada 200 µL adicionales de reactivo TRIzol, seguidos de 200 µL de cloroformo, y agite mediante vortex durante 1 min. Centrifugue a 13400 x g durante 15 min a 4 °C. Asegúrese de una correcta separación de fases tras la centrifugación. </li>
		<li>Transfiera cuidadosamente la fase acuosa a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mL. </li>
		<li>Precipite el ARN añadiendo 500 µL de isopropanol a la fase acuosa e incube a −80 °C durante 30 min a 1 h. </li>
		<li>Forme el precipitado de ARN mediante centrifugación a 15000 x g durante 20 min a 4 °C. Observe cuidadosamente el precipitado y retire el sobrenadante sin perturbarlo. </li>
		<li>Resuspenda el precipitado con 1 mL de etanol al 75% y centrifugue a 13400 x g durante 1 min a 4 °C. Repita este paso dos veces, seque el precipitado al aire durante 30 min a temperatura ambiente y resuspenda en 50 µL de agua libre de nucleasas. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Método con kit comercial de extracción de ARN
	<ol>
		<li>Resuspenda el precipitado celular en 200 µL de tampón de resuspensión (incluido en el kit). </li>
		<li>Siga el método de lisis celular descrito en los pasos 2.1.2 - 2.1.3. </li>
		<li>Realice el experimento subsiguiente según las instrucciones del fabricante. </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Tratamiento con DNasa, cuantificación y visualización
<ol>
	<li>Para eliminar la contaminación con ADN genómico, agregue 1 µL de DNasa I (10 unidades) y 5 µL de tampón RDD (1x) a cada muestra de ARN e incube a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Cuantifique la muestra de ARN espectrofotométricamente utilizando Nanodrop y la integridad del ARN utilizando un Qubit4. El valor aceptado de RIN está entre 7,5 y 10. Los valores aceptados de A260/A280 y A260/A230 están en el rango de 1,8 a 2,0 y de 2,0 a 2,2, respectivamente.</li>
	<li>Visualice el ARN en un gel de agarosa al 1 % utilizando colorante de carga 1X para ARN.</li>
</ol>
4. Síntesis de ADNc y PCR cuantitativa en tiempo real
<ol>
	<li>Prepare una reacción de 20 µL para la preparación de ADNc utilizando el kit de Transcripción Reversa de ADNc y 1 µg de ARN, siguiendo las instrucciones del fabricante en un termociclador.</li>
	<li>Prepare una reacción de PCR en tiempo real de 10 µL utilizando 50 ng de ADNc, 0,4 µM de cada cebador y SYBR según las instrucciones del fabricante. Ejecute la muestra en el termociclador de PCR en Tiempo Real. 
	NOTA: Se utilizaron los siguientes cebadores para el análisis de qPCR: 
	Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3' 
	Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3' 
	Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3' 
	Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3' 
	Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3' 
	Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'</li>
</ol>
5. Análisis estadístico
<ol>
	<li>Realice la prueba de Student’s prueba t con todos los réplicas biológicos utilizando Graph Pad Prism, P Se consideró estadísticamente significativo un valor ≤ 0,05. Las barras de error representan el error estándar de al menos tres réplicas biológicas.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+tuberculosis+report%2C+2024%22">Global tuberculosis report, 2024</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/b/74877">https://www.who.int/publications/b/74877</a> (2024).</li>
<li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-resistant+tuberculosis%3A+An+update+on+disease+burden%2C+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment.</a> Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).</li>
<li>Tailleux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+host-pathogen+cross-talk+by+transcriptional+profiling+of+both+Mycobacterium+tuberculosis+and+infected+human+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages.</a> PLoS One. 3 (1), e1403(2008).</li>
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<li>Arnvig, K. B., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+RNAs+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of small RNAs in Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 73 (3), 397-408 (2009).</li>
<li>Brennan, P. J., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+envelope+of+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The envelope of mycobacteria.</a> Annu Rev Biochem. 64, 29-63 (1995).</li>
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<li>Rustad, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+stability+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).</li>
<li>Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+of+RNA+extraction+from+bacteria+refractory+to+disruption%2C+including+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria.</a> Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).</li>
<li>Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+efficient+method+for+the+isolation+of+DNA-free%2C+pure+and+intact+RNA+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis.</a> J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).</li>
<li>Hiebert, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+extraction+and+RNA-sequencing+method+for+transcriptomic+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis.</a> Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).</li>
<li>Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine-rich+peptides+potently+bind+ESAT6%2C+a+virulence+determinant+of+Mycobacterium+tuberculosis%2C+and+concurrently+affect+the+pathogen%27s+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth.</a> PLoS One. 4, e7615(2009).</li>
<li>Alli, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+RNA+extraction+in+Mycobacterium+tuberculosis+for+studying+intracellular+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Clin+Exp+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression.</a> Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).</li>
</ol>

No hubo conflictos de intereses entre los autores. Todos los autores han aprobado la presentación.

Para desarrollar un método sencillo y robusto de extracción de ARN para Mycobacterium, se optimizó el método de fenol caliente. Posteriormente, se comparó el ARN extraído con dos métodos ampliamente utilizados: TRIzol y un método basado en columnas12,13. Estas técnicas se compararon según el rendimiento, pureza, integridad, costo y tiempo de procesamiento del ARN, con el fin de evaluar su practicidad para aplicaciones moleculares posteriores. Tanto el método del fenol caliente como el método con TRIzol, aunque relativamente más lentos en comparación con el método basado en kits, produjeron ARN intacto y de alta calidad. Los tres métodos generaron ARN con pureza e integridad comparables; sin embargo, el método del fenol caliente proporcionó consistentemente un mayor rendimiento de ARN. Además, el ARN extraído mediante los métodos del fenol caliente y con TRIzol arrojó valores de Ct similares. No obstante, se observó una diferencia estadísticamente significativa en los valores de Ct entre los métodos del fenol caliente y RNeasy. Dado que se utilizaron cantidades iguales de ARN en el experimento, se esperaban valores de Ct similares en todos los métodos. Las diferencias observadas en el caso del método RNeasy podrían atribuirse a variaciones en la química de extracción del ARN. El fenol caliente y el TRIzol son métodos basados en compuestos orgánicos y suelen ser más eficaces para solubilizar transcritos difíciles, como aquellos que codifican proteínas de membrana intrínsecas o transcritos con alto contenido de GC. En contraste, RNeasy es un método basado en columnas de sílice y puede dar lugar a una recuperación menor de ciertos transcritos que no se unen eficientemente a la membrana o que se pierden durante los pasos de lavado, en comparación con los métodos basados en fenol.Figura 2). Es importante destacar que se obtuvieron rendimientos de ARN comparables utilizando ya sea un homogenizador manual de tejidos o un ruptor por bolas para la lisis celular, lo que permite flexibilidad operativa en la realización de la lisis celular. Además, el método de extracción se optimizó para trabajar con volúmenes bajos de cultivo y sin necesidad de centrifugación en frío. Esta simplificación mejora la facilidad y eficiencia general del procesamiento de muestras.
Un factor importante al seleccionar un método de extracción de ARN es equilibrar el costo, el tiempo y la calidad del producto final (Tabla 1). El método de fenol caliente, aunque requiere un tiempo ligeramente mayor, sigue siendo altamente rentable debido al uso de reactivos de laboratorio comunes y su capacidad para producir altos rendimientos de ARN (ARN de Msmeg: 60–70 µg y ARN de Mtb: 35–45 µg por 3 mL de cultivo en fase logarítmica media) incluso a partir de volúmenes bajos de cultivo (3 mL) y sin necesidad de equipos sofisticados de ruptura con perlas, que son utilizados por la mayoría de los métodos publicados hasta ahora. Esto lo hace particularmente ventajoso para laboratorios que operan en condiciones con recursos limitados. Los métodos previamente publicados de extracción de ARN basados en fenol caliente difieren en varios aspectos clave. Por ejemplo, Mangan et al. utilizaron M. bovis para la extracción de ARN mediante el método de fenol caliente, reportando un rendimiento de aproximadamente 20 µg de ARN por 109 células. Sin embargo, parámetros críticos como el volumen de cultivo y la temperatura de extracción no fueron especificados claramente. Además, su método incluye un lavado con detergente utilizando Divolab-1 antes de la ruptura mecánica celular, un reactivo que no está fácilmente disponible, seguido de la extracción con cloroformo y alcohol isoamílico11. En otro método de fenol caliente, se extrajo ARN de células de Mtb, obteniendo aproximadamente 39 µg de ARN total, lo cual es comparable con el método optimizado descrito aquí. No obstante, este método requirió un volumen de cultivo relativamente alto (25 mL), lo que aumenta el tiempo de procesamiento y exige el uso de centrífugas de mayor tamaño. Además, la extracción implica una mezcla de cloroformo–alcohol isoamílico, y no se reporta la temperatura de extracción12,14. TRIzol también se utiliza ampliamente para obtener buen rendimiento y calidad de ARN a un costo moderado15; sin embargo, el rendimiento fue comparativamente bajo. El kit RNeasy ofrece mayor comodidad y velocidad, lo que lo hace adecuado para flujos de trabajo sensibles al tiempo o para usuarios menos experimentados, pero a un costo considerablemente más alto que los otros dos métodos, y con un rendimiento significativamente bajo. En resumen, el método descrito aquí proporciona flexibilidad operativa en la lisis de células micobacterianas y la subsiguiente extracción de ARN. Permite a los usuarios elegir el método más adecuado según sus prioridades, ya sea costo y rendimiento o tiempo de procesamiento, manteniendo al mismo tiempo una calidad e integridad de ARN comparables en los tres métodos.

M. tuberculosis (Mtb), el agente causal de la tuberculosis (TB), sigue siendo la principal causa de muerte por un solo patógeno infeccioso, superando al VIH/SIDA. En 2024, la TB provocó aproximadamente 1,3 millones de muertes en todo el mundo1. Esta carga se ve agravada por la creciente prevalencia de cepas resistentes a múltiples fármacos (MDR) y resistentes de forma extensa a los fármacos (XDR). Por lo tanto, existe una necesidad urgente de comprender la base molecular de la patogénesis de la TB e identificar nuevos objetivos terapéuticos2.
El perfilado transcripcional de Mtb se ha convertido en una herramienta importante para elucidar los elementos funcionales implicados en las interacciones huésped-patógeno3, la adaptación al estrés ambiental4 y los mecanismos subyacentes a la resistencia a fármacos5. Metodologías avanzadas como la PCR en tiempo real, las microarrays y la secuenciación de ARN (ARN-seq) han mejorado significativamente la capacidad de analizar el transcriptoma micobacteriano6. Sin embargo, el éxito de estos métodos depende en gran medida de la disponibilidad de ARN de alta calidad, lo cual a su vez depende de una lisis celular eficiente durante la extracción. La pared celular compleja de Mtb, compuesta por micolil–arabinogalactano–peptidoglucano, hace que la extracción de ARN sea particularmente difícil7. Las técnicas de lisis existentes, incluyendo la hidrólisis enzimática8, la sonicación9 y el batido con perlas10, a menudo requieren equipos costosos y grandes volúmenes de cultivo, lo que limita su practicidad en muchos laboratorios BSL-3. Además, la tasa de crecimiento lento de Mtb requiere tiempos prolongados de cultivo para obtener suficiente biomasa11.
Para superar estas limitaciones, se desarrolló un método optimizado de extracción de ARN basado en fenol caliente que es rápido y económico. Utilizando solo 3 mL de cultivo en fase logarítmica media, el método proporciona entre 45 y 60 µg de ARN de alta calidad, adecuado para análisis transcripcionales posteriores. La lisis celular se logra mediante un molinillo de tejidos portátil y compacto, junto con reactivos fácilmente disponibles, eliminando la necesidad de instrumentos costosos. Aunque el método de fenol caliente ya ha sido descrito previamente11,12, la versión optimizada mejora la comodidad, la rentabilidad y el rendimiento de ARN. La optimización se realizó utilizando M. smegmatis mc2155 (Msmeg) y se validó con éxito con Mtb H37Rv.

<table><tbody><tr><td>Perlas de sílice de 0,1 mm</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP116911050</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 4&amp;nbsp;</td><td>revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga fría</td><td>ThermoScientific</td><td>42541217</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I&amp;nbsp;</td><td>qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>sigma</td><td>E02SS</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>SRL</td><td>62889</td><td></td></tr><tr><td>Bloque térmico</td><td>MIULAB</td><td>MU-E02-1049</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Molinillo de tejidos accionado por motor G10</td><td>Coron</td><td>G22616008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Nanofotómetro N50&amp;nbsp;</td><td>IMPLEM</td><td>T51601</td><td></td></tr><tr><td>Fenol equilibrado con tampón de citrato 0,1 M, pH 4,5</td><td>Sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Fluorímetro Qubit 4&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2.32262E+12</td><td></td></tr><tr><td>Ciclador térmico para PCR en tiempo real</td><td>Analytik Jena AG</td><td>844-00503-2</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNA easy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Ciclador térmico&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>621BR29739</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo TRI</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Base de Tris</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>516732</td><td></td></tr></tbody></table>

extracción de arn optimizada basada en fenol caliente de micobacterias: un enfoque robusto para el análisis fiable de la expresión génica

Optimized Hot Phenol&#8211;Based RNA Extraction from Mycobacteria: A Robust Approach for Reliable Gene Expression Analysis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) sigue siendo una amenaza importante para la salud global, lo que subraya la necesidad de estudios transcriptómicos confiables para comprender su biología y los mecanismos de resistencia a fármacos. Dichos análisis dependen de la obtención de ARN de alta calidad y alto rendimiento. Aunque existen varios métodos de extracción de ARN, muchos requieren reactivos costosos, grandes volúmenes de cultivo o equipos especializados, lo que limita su idoneidad para estudios a gran escala, especialmente en entornos con recursos limitados. Aquí se presenta un método optimizado de extracción de ARN basado en fenol caliente, diseñado específicamente para micobacterias. El método utiliza un volumen mínimo de cultivo y reactivos comúnmente disponibles para obtener de forma consistente ARN de alta calidad, adecuado para aplicaciones transcriptómicas de alto rendimiento. La cantidad y la integridad del ARN se evaluaron mediante electroforesis en gel y análisis de integridad del ARN (RIN), y su idoneidad para aplicaciones posteriores se confirmó mediante qPCR y Qubit 4. Para evaluar el desempeño del método optimizado, se realizó una extracción paralela de ARN utilizando TRIzol y RNeasy en condiciones experimentales idénticas, incluyendo la misma especie de Mycobacterium, volumen de cultivo, fase de crecimiento (logarítmica y estacionaria) y condiciones de lisis. Esto permitió una comparación directa de rendimiento, calidad, viabilidad y costo. El método optimizado de fenol caliente mostró un rendimiento y calidad de ARN comparables o superiores, reduciendo significativamente el costo de los reactivos y la dependencia de equipos especializados. Debido a su eficiencia, reproducibilidad y bajo costo, este protocolo ofrece una alternativa práctica para estudios a gran escala de expresión génica y transcriptómicos en Mtb y otras especies de micobacterias.

Calidad y rendimiento del ARN
La calidad y cantidad de ARN se evaluaron mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 2). Se observaron bandas distintas y nítidas correspondientes al ARNr 23S y 16S con todos los métodos de extracción, lo que confirma el aislamiento exitoso de ARN total. Los métodos de fenol caliente y TRIzol mostraron tres bandas claras que representan el ARNr 23S (~2900 pb), 16S (~1500 pb) y 5S (~120 pb), lo que indica ARN intacto y de alta calidad. En contraste, el método con kit basado en columnas mostró únicamente las bandas de 23S y 16S, mientras que la banda de ARNr 5S estuvo ausente o por debajo del límite de detección, probablemente debido a la pérdida preferencial de ARN pequeños durante la purificación en columna. Cuantitativamente, el método de fenol caliente produjo 1,5 a 2 veces más ARN que los métodos TRIzol y RNeasy, respectivamente.Figura 2A, C). Los rendimientos promedio fueron ~60 µg para Fenol Caliente, ~45 µg para TRIzol, y ~30 µg para RNeasy, lo último representa aproximadamente un 50 % menos de rendimiento que el fenol caliente. A pesar de las diferencias en el rendimiento, la integridad y pureza del ARN fueron comparables entre los métodos (Figura 2D, E).
Para evaluar la eficiencia del método de lisis, también se extrajo ARN utilizando un ruptor de perlas. Se obtuvieron rendimientos, calidad e integridad comparables, lo que demuestra que se puede lograr una lisis eficaz utilizando un molinillo de tejidos manual sencillo, sin depender de equipos especializados como un ruptor o batidora de perlas (Figura 2B,F–H).
Dado que Mtb es más resistente a la lisis que Msmeg, validamos aún más el método de fenol caliente optimizado utilizando la cepa Mtb H37Rv. La lisis celular mediante el molinillo de tejidos y el ruptor por bolas produjo ARN de buen rendimiento, calidad e integridad (Figura 3A–D), confirmando la robustez del método. Aunque la extracción de ARN utilizando un molinillo manual de tejidos tuvo un rendimiento menor (~35–45 µg/3 mL de cultivo) en comparación con el ruptor de perlas (50–60 µg/3 mL), se encontró que la diferencia no era estadísticamente significativa, y además la cantidad estaba dentro del rango aceptable suficiente para estudios de expresión génica a gran escala. Todas las extracciones de ARN se repitieron múltiples veces, y se presentan todos los réplicas biológicos independientes. Se realizó un análisis de densitometría en las imágenes de los geles, lo cual valida aún más las diferencias estadísticas en el rendimiento de ARN entre los diferentes métodos, siendo el método de fenol caliente el que produce el mayor rendimiento (Suplementario Figura 1A–D).
Pureza e integridad del ARN
Todos los métodos produjeron ARN con relaciones A260/A280 aceptables alrededor de 2,0, lo que indica una contaminación mínima de proteínas (Figura 2D). La integridad del ARN (RIN) fue comparable entre todos los métodos, con valores que oscilaron entre 7,5 y 10 (Figura 2D–H, Figura Suplementaria 2, panel inferior). Esto indica una buena calidad, integridad y degradación mínima.
Análisis de PCR cuantitativa para verificar la calidad del ARN 
Para evaluar la idoneidad del ARN extraído por cada método para estudios posteriores de expresión génica, se realizó una qRT-PCR. Se analizó la expresión génica del gen esencial mysA (MSMEG 2758) de Msmeg y de dos reguladores transcripcionales, sigE (MSMEG 5072) y sigH (MSMEG 1914), utilizando cantidades equivalentes de ARN de entrada. Los valores de Ct (umbral de ciclo) obtenidos reflejan la abundancia relativa de ARN intacto y amplificable en cada muestra. Como se muestra en (Figura 2I), el ARN extraído mediante el método de fenol caliente y TRIzol produjo valores de Ct comparables, en un rango aproximado de 22–25, lo que indica una mayor integridad del ARN y compatibilidad con la transcripción inversa y la amplificación. Aunque el método con kit mostró valores de Ct ligeramente más altos (~27–30), lo que sugiere niveles más bajos de transcripción detectable. El análisis de la curva de disociación mostró una amplificación específica de los genes mysA, sigE y sigH, lo que demuestra la especificidad y eficiencia de la qPCR (Figura suplementaria 2, panel superior). El análisis de qPCR utilizando genes de Mtb también mostró valores de Ct aceptables (~20–25), confirmando su idoneidad para estudios posteriores de expresión génica (Figura 3E).
<img alt="Comparación de la extracción de ARN; electroforesis en gel (28S, 18S, 5S) y gráficos de barras de rendimiento, Ct y pureza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Comparación de métodos de extracción de ARN para Mycobacterium. (AElectroforesis en gel de agarosa que muestra ARN total extraído mediante los métodos de fenol caliente, TRIzol y RNeasy. En todas las muestras son visibles bandas distintas de ARNr 23S y 16S, lo que indica ARN intacto.BElectroforesis en gel de agarosa que muestra ARN total extraído utilizando fenol caliente mediante diferentes métodos de lisis, es decir, ruptor con perlas y molino de tejidos manual. (CRendimiento total de ARN, mostrando el mayor rendimiento con el método de fenol caliente, seguido por TRIzol y el método con kit.DLa pureza del ARN se evaluó mediante las relaciones A260/A280, obteniéndose valores alrededor de ~2,0 en todos los métodos, lo que indica una contaminación mínima por proteínas.E) Número de integridad del ARN (RIN) que muestra integridad comparable.F–H) Comparación del rendimiento de ARN, relación 260/280 e integridad del ARN entre muestras lisadas mediante homogenizador manual de tejidos y con el Bead Ruptor, y aisladas utilizando el método de fenol caliente.I) Valores de Ct de qRT-PCR dirigida a un gen de referencia (por ejemplo, mysA) y factores de transcripción (sigE y sigH). Las barras de error representan el error estándar de tres réplicas biológicas (n = 3). P-valor calculado utilizando la prueba t de Student prueba t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig2largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Comparación de la extracción de ARN de Mycobacterium, electroforesis en gel y gráficos de barras que analizan el rendimiento y la pureza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig3.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Aislamiento de ARN de Mtb utilizando el método de fenol caliente. (A) Electroforesis en gel de agarosa que muestra el ARN total extraído utilizando el ruptor de perlas y el homogenizador manual de tejidos con el método optimizado de fenol caliente a partir de la cepa Mtb H37Rv. (B–D) Comparación del ARN aislado en términos de rendimiento, relación 260/280 y estimación de la integridad del ARN (RIN). (E) Valores de Ct obtenidos mediante qRT-PCR dirigida a los genes sigA, ARNr 16s y hsp70. Las barras de error representan el error estándar de tres réplicas biológicas (n = 3). El valor de P se calculó utilizando la t-prueba de Student. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Fenol caliente</td>
			<td>Trizol</td>
			<td>Kit RNeasy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rendimiento</td>
			<td>60 -70 μg</td>
			<td>35 -50 μg</td>
			<td>30 - 45 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiempo</td>
			<td>2,5-3 h</td>
			<td>2-2,5 h</td>
			<td>30-45 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costo por reacción</td>
			<td>$0,10 – $0,20</td>
			<td>$1,500 – $2,00</td>
			<td>$7,00 – $10,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limitaciones</td>
			<td>Proceso lento, uso de agentes desnaturalizantes fuertes (fenol/SDS)</td>
			<td>Proceso lento, reactivos altamente tóxicos como el Trizol, necesidad de centrífuga fría, 15 veces más costoso que el método de fenol caliente</td>
			<td>Costoso (72 veces más que el método de fenol caliente), menor rendimiento, obstrucción de columnas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventajas</td>
			<td>Mayor rendimiento a partir de menor volumen, bajo costo, no requiere homogeneizador para la lisis celular, no requiere centrifugación en frío</td>
			<td>Rendimiento y costo moderados, requiere centrifugación en frío</td>
			<td>Rendimiento moderado, muy costoso</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Principal factor de costo</td>
			<td>Reactivos comunes de laboratorio (componentes del tampón TES, fenol ácido, cloroformo, isopropanol, etanol)</td>
			<td>TRI Reagent® comercial, cloroformo o cloroformo:alcohol isoamílico, isopropanol, etanol</td>
			<td>Columnas y tampones de centrifugación Qiagen de propiedad exclusiva</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIN</td>
			<td>8-10 RIN</td>
			<td>7,5-10 RIN</td>
			<td>9-10 RIN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Comparación de costo, tiempo y limitaciones entre tres procedimientos diferentes de extracción de ARN (métodos con fenol caliente, TRIzol y RNeasy).
Figura suplementaria 1: Optimización de la extracción de ARN. (A) Extracción de ARN utilizando fenol caliente y lisis con un homogenizador manual de tejidos. (B) Extracción de ARN utilizando TRIzol.C) Extracción de ARN utilizando el método RNeasy.D) Análisis de densitometría de imágenes de geles de extracción de ARN de Msmeg utilizando diferentes métodos. Las barras de error representan el error estándar calculado utilizando GraphPad Prism (n = 8). (E) Extracción de ARN utilizando fenol caliente de la cepa de Mtb. Todas las imágenes de geles son réplicas biológicas independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/Figure%20S1.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 2: (Panel superior) Análisis de la curva de fusión de mysA, sigE y sigH de M. smeg, n = 3; (Panel inferior) Análisis de la integridad del ARN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/Figure%20S2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este estudio optimiza un método de extracción de ARN basado en fenol caliente para Mycobacterium, obteniendo ARN de alta calidad adecuado para análisis transcriptómicos. Al compararlo con TRIzol y RNeasy en condiciones idénticas, el método proporcionó un mayor rendimiento, integridad comparable y una eficiencia de costos mejorada, ofreciendo una alternativa práctica para estudios a gran escala de expresión génica.

Extracción de ARN optimizada basada en fenol caliente de micobacterias: un enfoque robusto para el análisis fiable de la expresión génica

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