Visualizando al guardián: evaluación basada en el tinte azul de Evan de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica en peces cebra adultos

Esta investigación se centra en el desarrollo de un método confiable, simple y rentable para evaluar la integridad de la barrera hematoencefálica en peces cebra adultos. La mayoría de los estudios sobre el pez cebra no tienen una forma fácil y confiable de medir la interrupción de la barrera hematoencefálica, y los métodos existentes suelen ser complejos o costosos. Por lo tanto, este protocolo ofrece una solución práctica y asequible.

Este protocolo es simple, rentable y combina análisis visuales y medibles, todo sin la necesidad de equipos costosos o pasos complicados. Al proporcionar un protocolo simple y reproducible, facilitará a los laboratorios explorar los cambios neurovasculares en los modelos de enfermedad del pez cebra adulto. Para comenzar, anestesia al pez cebra bajando gradualmente la temperatura del agua de 12 grados centígrados a siete grados centígrados hasta que el pez ya no responda a los estímulos táctiles.

Con una jeringa de insulina de calibre 31, inyecte 20 microlitros de azul Evans al 1%, o tinte EB, en la cavidad intraperitoneal del pez y aplique una presión suave en el lugar de la inyección durante 10 segundos para evitar el reflujo. Ahora transfiera el pescado a un tanque de recuperación y deje que se recupere durante 30 minutos. Monitoree a los peces para detectar lesiones, mortalidad o cambios de comportamiento durante este tiempo.

Para establecer un control positivo, prepare una aguja estéril de calibre 31 conectada a una jeringa de insulina para realizar un procedimiento de lesión por herida de arma blanca. Después de un período de recuperación de 30 minutos, anestesiar al pez nuevamente, como se demostró anteriormente. Coloque el pescado en posición vertical sobre una superficie plana y fría, como una bolsa de gel de hielo.

Inserte la aguja en un lado del céfalo en un ángulo de 90 grados a una profundidad que no exceda los 1,5 milímetros. Luego transfiera el pescado a un tanque de recuperación y déjelo recuperar durante 30 minutos. Después de sacrificar al pez por hipotermia, use una cuchilla estéril o tijeras quirúrgicas para decapitar al pez sacrificado.

Enjuague la cabeza dos veces en 1X PBS usando una proporción de 1:20 de pescado a PBS para eliminar el exceso de sangre y tinte azul Evans. Luego fije la cabeza en paraformaldehído al 4% usando una proporción de 1:20 de pescado a fijador e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Coloque la cabeza fija en una placa de Petri limpia y diseccione el cerebro con pinzas puntiagudas.

Agregue continuamente PBS gota a gota durante la disección para mantener el tejido hidratado y evitar que se seque. Enjuague el cerebro diseccionado dos veces en dos baños de PBS separados y coloque el pañuelo en una placa de agarosa al 1% para retener la humedad y evitar que se encoja. Observe los tejidos cerebrales disecados bajo un microscopio estereoscópico.

Para comenzar el análisis cuantitativo, descargue e instale el software Fiji y abra el archivo de imagen cerebral en Fiji. Realice la deconvolución de color seleccionando Imagen, seguido de Color, Deconvolución de color y elija RGB. Esto dará como resultado tres imágenes separadas que representan tonos rojos, verdes y azules.

Ahora, active la imagen del canal azul, generalmente etiquetada como Color 3, haciendo clic en la imagen. Conviértalo a escala de grises de 8 bits seleccionando Imagen, seguido de Tipo y 8 bits. A continuación, para medir la intensidad de gris de la imagen de 8 bits, establezca los parámetros de medición seleccionando Analizar y Establecer mediciones.

A continuación, elija el área y el valor de gris medio. Con la herramienta de selección de rectángulos, dibuje una región de interés de tamaño uniforme y mida la intensidad de los grises seleccionando Analizar, seguido de Medir. El pez cebra normal mostró un tono de piel marrón típico, y el pez cebra inyectado EB exhibió un tono azulado notable.

Para investigar la integridad de la barrera hematoencefálica en el modelo parkinsoniano de pez cebra adulto, se comparó la extravasación de colorante EB en los tejidos cerebrales entre el control inyectado con solución salina y el pez cebra parkinsoniano. En el grupo de control negativo, los vasos sanguíneos del cerebro parecían rojizos, lo que indica la ausencia de extravasación de colorante EB. Por el contrario, los grupos de control inyectado con solución salina, el control positivo y el parkinsoniano mostraron una coloración azulada en la vasculatura cerebral, lo que confirma la circulación sistémica exitosa del tinte EB.

Los cerebros disecados del grupo de control negativo parecían blanquecinos con vasos sanguíneos claramente visibles, lo que confirma la ausencia de tinción EB. En el grupo de lesiones de control positivo, la coloración azul intensa que rodea el tejido cerebral indicó una fuga de tinte debido a una interrupción deliberada de la barrera hematoencefálica. En el grupo inyectado con solución salina, la tinción EB permaneció confinada a los vasos sanguíneos, lo que indica una barrera hematoencefálica intacta.

El grupo parkinsoniano mostró un patrón de tinción azul más oscuro y difuso, lo que indica una fuga significativa del tinte EB y un compromiso de la barrera hematoencefálica. El análisis cuantitativo en escala de grises reveló valores de intensidad de grises significativamente más bajos en el grupo parkinsoniano en comparación con el grupo inyectado con solución salina.