Mutagénesis precisa de fagos con sistemas CRISPR-Cas asistidos por NgTET

Estudiamos la infección por fagos a nivel molecular. Esta es realmente ciencia fundamental. Sin embargo, no solo estamos haciendo la ciencia fundamental, sino que también estamos interesados en traducir esta ciencia fundamental en aplicaciones en las que usamos este conocimiento para estudiar la infección por fagos y usarlo para la ingeniería de fagos y para aplicaciones terapéuticas.

Uno de los desarrollos más recientes en el campo de la investigación de fagos es el descubrimiento de un sistema inmunológico bacteriano. Este sistema inmunológico está presente en todas las bacterias y ellas identificaron o generan herramientas para luchar realmente contra el fago. Sin embargo, el fago es bastante inteligente.

Un fago también pudo identificar herramientas y desarrollar herramientas que le permiten escapar de esos sistemas inmunológicos. Y una herramienta es en realidad la modificación de su ADN por modificación. Y esto es especialmente para nosotros, realmente interesante porque estudiar la naturaleza química de estas modificaciones del ADN que los fagos han generado para escapar del sistema inmunológico son realmente interesantes, y también nos permiten convertirnos en una herramienta para diseñar el fago al final.

En los últimos 10 años, grandes colegas de todo el mundo han desarrollado tecnologías maravillosas. Una de estas tecnologías es, por ejemplo, la secuenciación de próxima generación. Con base en esta tecnología, realmente podemos secuenciar fagos, pero también los genomas completos del huésped a nivel molecular.

Por otro lado, se desarrolló la espectrometría de masas, algo así como la proteómica. CRISPR es una herramienta maravillosa que ahora se aplica en varios reinos de la vida. Y también estamos usando esto ahora para diseñar el genoma del fago.

Estas son solo algunas tecnologías maravillosas que han cambiado la forma en que pensamos sobre los fagos en la actualidad. Cuando hablamos de desafíos actuales, uno de los desafíos que vemos es la ingeniería bio CRISPR de un genoma de fagos. El genoma del fago se modifica totalmente con modificaciones de ADN, y las ACE nucleares CRISPR en realidad no pueden escindir el ADN.

Así que este es realmente un desafío que debemos superar si queremos diseñar los genomas de los fagos bacterianos. Mi grupo ha descubierto un componente totalmente novedoso de los ARN. Descubrimos que las transcripciones específicas llevan en sus cinco extremos principales, el llamado espectro redox, nicotinamida adenina dinucleótido corto NAD, y descubrimos esto también recientemente por primera vez en las interacciones de fagos E-coli T4.

Con base en este descubrimiento, también identificamos que los ARN y las proteínas pueden interactuar entre sí de una manera totalmente novedosa. Descubrimos que este NAD que describí antes funciona como un pegamento molecular para unir ARN y proteínas entre sí. Esta euforia de ARN es una forma totalmente novedosa de cómo los ARN y las proteínas interactúan entre sí en la naturaleza.

E hicimos este descubrimiento en la interacción eco antifago. Ahora también estamos interesados en traducir esta ciencia fundamental en aplicaciones, por ejemplo, en el campo de la terapéutica basada en ARN. Para comenzar, trate 500 microlitros de suspensión de fagos con 20 unidades de ADN 1.

Agregue dos microlitros de ARN AT1 mezclados al tubo. Incube la mezcla tratada a 37 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, cargue 500 microlitros de la solución de fagos tratada sobre un gradiente de sacarosa preparado.

Centrifugar el gradiente a 70.000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Ilumine el tubo de centrifugación desde la parte inferior para visualizar la banda de fagos turbios en el gradiente. Luego, con una cánula roma, retire con cuidado la fracción que contiene el fago en un nuevo tubo de ultra ultracentrifugación.

Ahora, agregue 30 mililitros de tampón TM helado al tubo y centrifuge. A continuación, vuelva a suspender el gránulo en 500 microlitros de tampón TM después de desechar el sobrenadante. Almacene los fagos resuspendidos en un vial de vidrio a cuatro grados centígrados durante la noche.

Agregue un microgramo de proteinasa K a los fagos resuspendidos. Incube la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Luego agregue un volumen igual de mezcla de cloroformo fenol y alcohol isoamílico a la muestra.

Invierta para mezclar bien y centrifugar. Transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo de reacción y repita la extracción tres veces. Realice tres extracciones de cloroformo utilizando un volumen igual de cloroformo para eliminar el fenol residual.

Luego precipite el ADN agregando 0,1 volumen de acetato de sodio de tres molares a PH 5,5 y 2,5 volúmenes de etanol. Incube la mezcla durante la noche a menos 20 grados centígrados. Al día siguiente, centrifugar la muestra a 15.000 G durante una hora a cuatro grados centígrados para granular el ADN.

Lave el gránulo de ADN dos veces con 200 microlitros de etanol al 70%. Agite suavemente el tubo y vuelva a centrifugar. Retire con cuidado el sobrenadante.

Luego, suspenda el ADN purificado en agua ultrapura. Almacene el ADN a menos 20 grados Celsius hasta su uso posterior. Inocular células Escherichia coli BL 21D 3 que se transforman tanto con el plásmido PET 28 NGTet como con un plásmido de expresión CAS 12 o CAS 9.

Cultivar el cultivo en medio LB suplementado con antibióticos apropiados a 37 grados centígrados con agitación. Induzca la expresión de NG TED agregando 0,05 milimolares de IPTG e incube durante dos horas adicionales a 37 grados Celsius. Como control, compare las cepas de E. coli BL 21 D3 con y sin sobreexpresión de NgTET.

Transfiera 300 microlitros de los cultivos de E. coli a un tubo estéril. Infecte el cultivo con T4 de tipo salvaje o fago tratado con NgTET con una multiplicidad de infección de 0,01. Mezclar suavemente para asegurar una distribución uniforme de los fagos y luego incubar nuevamente.

Agregue la mezcla de fagos bacterianos a cuatro mililitros de barrena blanda LB que contenga una barrena al 0,75% y antibióticos. Mezcle bien, pero suavemente para evitar la formación de burbujas. Vierta la mezcla de barrena suave en una placa de barrena LB precaliente.

Deje que la placa se solidifique brevemente a temperatura ambiente e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, cuente las placas para determinar el número de unidades formadoras de placa. Para la selección del contador, infecte E. coli lanzando un espaciador de 13 A utilizando los fagos que se seleccionarán en el contador.

Realice la selección del contador en las mismas condiciones utilizadas para la mutagénesis. Después de la incubación, filtre el natante de SUP a través de un filtro de 0,45 micrómetros para eliminar los desechos bacterianos. Utilice el contador de fagos seleccionados y filtrados para un ensayo de placa en una cepa de E. coli B para aislar placas individuales para su validación posterior.

La banda del fago era claramente visible cuando la muestra del fago T4 estaba suficientemente concentrada. La expresión de la proteína NgTET en E. coli fue confirmada por el fago SDS que muestra su presencia tanto en fracciones solubles como insolubles después de la lisis celular y la centrifugación. Los cromatogramas mostraron que las abundancias relativas de dioxiadenosina, diyodohidroxiquinolina y timidina no cambiaron entre el ADN del fago T4 de tipo salvaje y el tratado con NgTET.

La abundancia de derivados de citosina modificados se redujo significativamente en el ADN del fago tratado con NgTET en comparación con la muestra no tratada. Se construyó un plásmido que contenía el gen NgTET y regiones de homología para la mutagénesis dirigida mediante clonación de puerta dorada. El cribado por PCR confirmó la amplificación exitosa de la yegua del gen diana en los carriles dos a nueve del agros gel, lo que indica resultados positivos entre las placas seleccionadas.

En el ADN del fago T4 de tipo salvaje, la abundancia relativa de 5 glicosilhidroxietil 2 deoxidina principal fue alta. En el ADN del fago T4 tratado con NgTET, los niveles de 5 glicosilhidroxietil 2 deoxidina principal se redujeron fuertemente en comparación con el tipo salvaje. El ADN del fago T4 tratado con el mutante catalítico inactivo NgTET D234 A retuvo altos niveles de 5 glicolhidroxietil 2 deoxidina principal.

La progenie recuperada del fago T 4 mostró niveles casi restaurados de 5 hidroximetil 2 deoxidina principal en comparación con el tipo salvaje.