Name: Mutagénesis precisa de fagos con sistemas CRISPR-Cas asistidos por NgTET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprende mutagénesis CRISPR-Cas sin cicatrices en bacteriófagos usando la enzima NgTET para reducir modificaciones del ADN. Este método mejora la ingeniería genética de fagos para aplicaciones en biotecnología y terapia fágica.

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<ol><li>Pozhydaieva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+epigenome+modulation+enables+efficient+bacteriophage+engineering+and+functional+analysis+of+phage+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications.</a> PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).</li>
<li>Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+as+drivers+of+bacterial+virulence+and+their+potential+for+biotechnological+exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation.</a> FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).</li>
<li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), 205(2018).</li>
<li>Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+omics+reveal+time-resolved+insights+into+T4+phage+infection+of+E.+coli+on+proteome+and+transcriptome+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels.</a> Viruses. 14 (11), 2502(2022).</li>
<li>Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+genome+engineering+for+phage+therapy+to+combat+bacterial+antimicrobial+resistance+as+an+alternative+to+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics.</a> Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).</li>
<li>Vlot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+DNA+glucosylation+impairs+target+DNA+binding+by+type+I+and+II+but+not+by+type+V+CRISPR-Cas+effector+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes.</a> Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).</li>
<li>Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+bacteriophage+T4+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9.</a> ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), aad5147(2016).</li>
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<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
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<li>Dedrick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacteriophages+for+treatment+of+a+patient+with+a+disseminated+drug-resistant+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus.</a> Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).</li>
<li>Marinelli, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRED%3A+a+simple+and+powerful+tool+for+constructing+mutant+and+recombinant+bacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes.</a> PLoS One. 3 (12), e3957(2008).</li>
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<li>Ramírez Rojas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DuBA.Flow%E2%94%80a+low-cost%2C+long-read+amplicon+sequencing+workflow+for+the+validation+of+synthetic+DNA+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs.</a> ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).</li>
<li>Lagerbäck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+T4+endonuclease+II%2C+a+promiscuous+GIY-YIG+nuclease%2C+binds+as+a+tetramer+to+two+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates.</a> Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).</li>
<li>Lagerbäck, P., Carlson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+in+the+GIY-YIG+endonuclease+II+of+phage+T4+affecting+sequence+recognition+and+binding+as+well+as+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis.</a> J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).</li>
<li>Shembrey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+CRISPR-Cas13+mismatch+intolerance+enable+selective+silencing+of+point-mutated+oncogenic+RNA+with+single-base+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision.</a> Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).</li>
<li>Molina Vargas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+design+strategies+for+ultra-specific+CRISPR-Cas13a-based+RNA+detection+with+single-nucleotide+mismatch+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).</li>
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<li>Levin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+and+evolutionary+dynamics+of+phage+and+bacteria+with+CRISPR-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).</li>
<li>Hershey, A. D., Chase, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+functions+of+viral+protein+and+nucleic+acid+in+growth+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage.</a> J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).</li>
<li>Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusion+of+glucosyl-hydroxymethylcytosine+DNA+containing+bacteriophages+is+overcome+by+the+injected+protein+inhibitor+IPI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI.</a> J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).</li>
</ol>

Los bacteriófagos son virus que se dirigen específicamente a las bacterias. Han atraído un gran interés en la investigación debido a su inmenso potencial en biotecnología y medicina, particularmente en la lucha contra las bacterias multirresistentes 1,2,3. A pesar de esto, la biología de los fagos sigue siendo relativamente poco estudiada. Una comprensión más profunda de sus mecanismos moleculares de secuestro de sus huéspedes bacterianos es esencial para aprovechar plenamente su potencial terapéutico y biotecnológico4. Para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la infección eficiente de fagos y diseñar los fagos para aplicaciones específicas, es esencial la capacidad de modificar genéticamente los genomas de los fagos. Sin embargo, sigue siendo uno de los desafíos más importantes en el campo de la biología de fagos 3,5,6.
El ADN de los fagos a menudo se modifica por alteraciones químicas específicas de las bases de purina y pirimidina, por ejemplo, glicosilación y metilación de citosina. Estas modificaciones protegen el material genético de los fagos del reconocimiento y la degradación por las nucleasas del huésped6. Si bien estas modificaciones son cruciales para la aptitud de los fagos, son un obstáculo importante para los enfoques de ingeniería del genoma de fagos que se basan en sistemas de orientación del ADN 2,3,7.
Las estrategias de mutagénesis existentes, incluidos los sistemas de restricción-modificación y las tecnologías basadas en proteínas asociadas a CRISPR (CRISPR) asociadas a CRISPR, enfrentan desafíos significativos al modificar el ADN de los fagos debido a modificaciones epigenéticas protectoras como la glicosilación de citosina8. La edición del genoma mediada por CRISPR-Cas, que es altamente efectiva en células bacterianas y eucariotas, se basa en dos pasos clave: la escisión precisa del ADN en loci genómicos específicos por la nucleasa Cas, seguida de la reparación del ADN a través de la recombinación homóloga con ADN del donante que porta la mutación deseada1. Sin embargo, en los fagos, las modificaciones del ADN a menudo impiden que las nucleasas de Cas se unan o escindan el genoma de manera eficiente. Además, la naturaleza rápida y transitoria de la replicación de fagos puede limitar aún más la eficiencia de la recombinación homóloga. Estas barreras dificultan especialmente la aplicación de la tecnología CRISPR-Cas dirigida al ADN para la mutagénesis de fagos. Se ha demostrado que las modificaciones del ADN de los fagos afectan la orientación del ADN de los fagos con CRISPR-Cas tanto in vitro como in vivo 6,7.
Para abordar los desafíos que plantean las modificaciones protectoras del ADN en los fagos, presentamos una estrategia de mutagénesis del genoma que aprovecha la actividad de la translocación diez-once (TET) metilcitosina dioxigenasa, específicamente NgTET. En eucariotas, las enzimas TET catalizan la oxidación escalonada de la citosina metilada a través de procesos iterativos: la metilcitosina (5mdC) se convierte primero en hidroximetilcitosina (5hmdC), luego en formilcitosina (5fdC) y finalmente en carboxicitosina (5cadC) (Figura 1).
En nuestro enfoque de mutagénesis de fagos, NgTET se utiliza para reducir temporalmente la abundancia de modificaciones protectoras del ADN, mejorando así la accesibilidad del ADN de los fagos a herramientas de edición del genoma como las enzimas Cas9. NgTET, fue seleccionado para modular el genoma del bacteriófago debido a informes previos de su expresión exitosa en forma soluble activa en un huésped bacteriano heterólogo, particularmente E. coli. Esta propiedad es esencial, ya que NgTET debe permanecer activo durante la infección por fagos10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69022/69022fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Oxidación escalonada de 5-metilcitosina por TET dioxigenasa1. La TET dioxigenasa cataliza la oxidación sucesiva de 5-metil-2'-desoxicitidina (5mdC) a 5hmdC, 5-formil-2'-desoxicitidina (5fdC) y, finalmente, a 5-carboxil-2'-desoxicitidina (5cadC). El producto final, 5cadC, ya sea espontánea o enzimáticamente, vuelve a la citosina (dC) no modificada, contribuyendo así a la regulación epigenética dinámica. Este proceso de varios pasos es fundamental para la metilación activa del ADN en eucariotas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69022/69022fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Dado que la metilcitosina y la hidroximetilcitosina son precursores comunes de las hipermodificaciones del ADN de los fagos, incluidas las estructuras protectoras voluminosas como las glicosilaciones, la actividad oxidativa de la TET dioxigenasa puede explotarse para prevenir la formación de estas hipermodificaciones del ADN9. En este enfoque de mutagénesis del genoma basado en TET, expresamos heterólogamente NgTET de forma recombinante en E. coli para oxidar citosinas hidroximetiladas en el genoma del fago tras la infección, evitando así la formación de glicosilación voluminosa. Al disminuir la abundancia de estas voluminosas modificaciones del ADN, nuestro enfoque puede aumentar la accesibilidad del ADN de los fagos a las nucleasas CRISPR-Cas. Esta accesibilidad mejorada facilita el reconocimiento eficiente de objetivos, la escisión precisa del ADN y la introducción de mutaciones puntuales sin cicatrices en el genoma del fago, distinguiéndolo de los métodos tradicionales de mutagénesis de fagos que se basan en deleciones de genes, inserciones de genes reporteros o la integración de uniones artificiales para la selección de mutantes basada en PCR 1,11. Estas estrategias convencionales han sido hasta ahora las únicas herramientas disponibles para la mutagénesis dirigida en genomas de fagos y, por lo tanto, representan una base importante para el método presentado aquí. Sin embargo, las proteínas de fagos individuales pueden poseer múltiples funciones. La eliminación de todo el gen que codifica una proteína de interés interrumpe todas las funciones asociadas. Por el contrario, la introducción selectiva de mutaciones puntuales permite la inactivación selectiva de funciones específicas, lo que permite un análisis detallado de sus funciones. Hasta la fecha, las funciones de muchas proteínas de fagos permanecen en gran medida sin caracterizar; por lo tanto, podemos pasar por alto actividades adicionales vinculadas a un gen determinado. Por lo tanto, se prefiere un enfoque minimalista que tenga como objetivo eliminar solo una función mientras causa cambios mínimos en la proteína general12,13. El método descrito aquí permite modificaciones genéticas precisas sin interrumpir la organización o función genómica general. Otro desafío importante de los métodos anteriores de mutagénesis de fagos ha sido su baja eficiencia, que generalmente produjo tasas de mutación de alrededor del 0,1%1,11. Con esta técnica, presentamos la primera estrategia de mutagénesis capaz de introducir cambios de codón único, logrando un notable aumento de siete veces en la eficiencia de la orientación. Al combinarlo con un método de cribado de alto rendimiento basado en ONT, se simplifica la detección de mutaciones puntuales, eliminando la necesidad de cribar grandes poblaciones de fagos para aislar un mutante. La estrategia de mutagénesis basada en TET descrita aquí aborda una limitación de larga data en el campo y permite una edición del genoma más confiable14.
En general, este método no solo se puede aplicar para avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos de infección por bacteriófagos, sino que también es muy prometedor para la biología sintética. Al permitir una ingeniería precisa y eficiente del genoma de los fagos, allana el camino para adaptar los fagos a aplicaciones específicas, mejorando así su potencial para aplicaciones biotecnológicas y médicas.

<table><tbody><tr><td>Tubos de reacción de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos canociales de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de pared delgada abiertos de 15 ml</td><td>Ciencias de la vida de Beckman Coulter</td><td>361706</td><td>16 mm x 95 mm (para ultracentrifugación)</td></tr><tr><td>Tubos canónicos de 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>5x búfer de GC</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>F519L</td><td></td></tr><tr><td>6x Tinte de carga de ADN TriTrack&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Referencia R1161</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>BIOCIENCIA de los meridianos</td><td>BIO-41025</td><td>Grado molecular</td></tr><tr><td>Centrífuga Avanti J-30I</td><td>Ciencias de la vida de Beckman Coulter</td><td>sin catálogo&nbsp; número</td><td>Serien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe</td></tr><tr><td>Ácido bórico&nbsp;</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF v2</td><td>NEB</td><td>R3733S</td><td></td></tr><tr><td>Hexahidrato de cloruro de calcio</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>7774-34-7</td><td>97 %, extra puro&nbsp;</td></tr><tr><td>Densímetro de celda</td><td>Biocromo de Harvard</td><td>80211630</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>VWR</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato de sodio</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>7558-79-4</td><td>Grado farmacéutico</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de vidrio desechables</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>230 milímetros</td></tr><tr><td>ADNasa I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>10 U/&micro; L</td></tr><tr><td>Mezcla de dNTP (10 mM cada dNTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>DS_SPcas_ModA</td><td>Producto propio.</td><td>https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps</td><td>Construcción de plásmido que contiene sgRNA CRISPR-Cas12/ModA</td></tr><tr><td>DS-spCas (sistema CRISPR-Cas9)</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>48645 (número de accesorio addGene)</td><td>Plásmido para la construcción de plásmidos CRISPR-Cas que contienen espaciadores (sistema CRISPR-Cas9) para la mutagénesis de fagos (paso 3.2)</td></tr><tr><td>Cepa B de E. coli La cepa se utilizó para la infección por T4</td><td>DSMZ</td><td>sin catálogo&nbsp; número</td><td>Escherichia coli (Migula 1895) Castellani y Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) Cepa de expresión, célula competente</td><td>Invitrogen</td><td>C600003</td><td>Cepa de expresión, células competentes.</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha; Cepa de clonación, células competentes</td><td>Invitrogen</td><td>18265017</td><td>Cepa de clonación, células competentes.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (absoluto)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>200-578-6</td><td></td></tr><tr><td>Célula de flujo flongle</td><td>Tecnologías de nanoporos de Oxford</td><td>sin catálogo&nbsp; número</td><td>R10.4.1. química, https://nanoporetech.com/document/flongle</td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmidos Gene JET&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>10242490</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Más escalera de ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Referencia SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de ADN GeneRuler ULR&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SM1213</td><td></td></tr><tr><td>Maestro de degradado 108</td><td>BIOCOMP</td><td>sin catálogo&nbsp; número</td><td>https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming</td></tr><tr><td>Centrífuga Heraeus Pico 17</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002410</td><td></td></tr><tr><td>Infors HT Incubadora Minitron</td><td>Infors AG</td><td>sin catálogo&nbsp; número</td><td>https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs</td></tr><tr><td>Isopropil-&beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Carl Roth</td><td>T832.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>Carl-Roth</td><td>Formato X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-medio (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl-Roth</td><td>Versión X968.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo MinION&nbsp;</td><td>Tecnologías de nanoporos de Oxfrod</td><td>sin catálogo&nbsp; número</td><td>https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html</td></tr><tr><td>ModA E165A_fw</td><td>IDT</td><td>GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT</td><td>Manual directo para la introducción de la mutación puntual para ModA E165A y para introducir extremos adhesivos para la clonación Golden Gate (Paso 3.1)</td></tr><tr><td>ModA E165A_rev</td><td>IDT</td><td>CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC</td><td>Cebador inverso para la introducción de la mutación puntual para ModA E165A y para introducir extremos adhesivos para la clonación Golden Gate (Paso 3.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_fw</td><td>IDT</td><td>TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG</td><td>Cebador directo para generar espaciador para sistemas CRISPR-Cas12 / CRISPR-Cas9 / CRISPR-Cas13 para mutagénesis y contraselección de fagos (paso 3.2 y paso 4.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_rev</td><td>IDT</td><td>AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC</td><td>Cebador inverso para generar espaciador para sistemas CRISPR-Cas12 / CRISPR-Cas9 / CRISPR-Cas13 para mutagénesis y contraselección de fagos (paso 3.2 y paso 4.1)</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop ND-1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AZY2019944</td><td></td></tr><tr><td>Kit NucleoMag</td><td>Machery Nagel</td><td>REF 744970.50</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de digestión de nucleósidos</td><td>Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra</td><td>M0649S</td><td></td></tr><tr><td>pBA560 (sistema CRISPR-Cas13)</td><td>Addgene</td><td>186236 (número de accesorio addgene)</td><td>Sistema CRISPR-Cas13 de codificación de plásmidos para contraselección (paso 4.1)</td></tr><tr><td>plásmido pCpfl-sp (sistema CRISPR-Cas12)</td><td>Addgene</td><td>122186</td><td></td></tr><tr><td>plásmido pCpfl-sp (sistema CRISPR-Cas12)</td><td>Addgene</td><td>122186 (número de accesorio addgene)</td><td>Plásmido para la construcción de plásmidos CRISPR-Cas que contienen espaciadores (sistema CRISPR-Cas12) para la mutagénesis de fagos (paso 3.2)</td></tr><tr><td>Recipientes de reacción de PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>PeqVERDE</td><td>VWR</td><td>732-3196</td><td></td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>Producto propio.</td><td>sin catálogo&nbsp; número</td><td>plásmido está disponible a pedido, el mapa de plásmidos se puede encontrar en el siguiente https://zenodo.org/records/10615143&nbsp;</td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>Producto propio.</td><td>sin catálogo&nbsp; número</td><td>Plásmido para la construcción de ADN pET28a_NgTET_donor mediante clonación Golden Gate (paso 3.1), plásmido&nbsp; está disponible a pedido, el mapa de plásmidos se puede encontrar en el siguiente https://zenodo.org/records/10615143&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td>92 x 16 mm con levas</td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>F-530XL</td><td>2 U/&micro; L</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>Monobásico</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación universal PowerPac</td><td>Bio Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Fluorímetro cuántico, sistema QuantiFluor dsDNA</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td></td></tr><tr><td>ARNasa A/T1&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0551</td><td>mezclar 2 mg/ml de ARNasa A 5000 U/ml de ARNasa T1&nbsp;</td></tr><tr><td>Roti-Aqua P/C/I para extracción de ADN&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>Formato X985.1</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de secuenciación de ligadura SQK-LSK109</td><td>Tecnologías de nanoporos de Oxford</td><td>sin catálogo&nbsp; número</td><td>https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109</td></tr><tr><td>Filtros Steritop, 0.22 &micro; m tamaño de poro</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td>250 ml y 500 ml</td></tr><tr><td>Estreptomicina 50 mg/L</td><td>Carl Roth</td><td>HP66.1</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>NeoFroxx GmbH</td><td>57-50-1</td><td>para biología molecular&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor de aluminio de cubeta oscilante</td><td>Ciencias de la vida de Beckman Coulter</td><td>JS[1]24.15</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN Ligasa 5 U/&micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de ADN ligasa T4</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>B69</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensayo, pared gruesa, sin borde</td><td>Karl Hecht GmbH</td><td>42775054</td><td>100 mm x 18 mm</td></tr><tr><td>Termociclador, T100</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Comodidad del termomezclador</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua, VWB2&nbsp;</td><td>VWR</td><td>462-0557</td><td>Volumen de 12 L</td></tr></tbody></table>

mutagénesis precisa de fagos con sistemas crispr-cas asistidos por ngtet

Precise Phage Mutagenesis with NgTET-Assisted CRISPR-Cas Systems

Identificación de la banda del fago en el gradiente. La visibilidad de la banda del fago en el gradiente depende de la concentración del fago en la muestra inicial cargada en el gradiente. Cuando el fago está suficientemente concentrado (~&gt;1 × 1011 PFU/mL), la banda se puede ver claramente iluminando el gradiente desde la parte inferior con una fuente de luz (ver Figura 3).
Sin embargo, a bajas concentraciones de fagos, la banda p...

Mutagénesis precisa de fagos con sistemas CRISPR-Cas asistidos por NgTET

Bacteriophages, viruses that specifically target their bacterial hosts, hold significant potential for biotechnology and medicine, especially in combating ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

La técnica de determinación del genotipo se describe aquí, que las parejas de reacción en cadena de la polimerasa fluorescente (PCR) para electroforesis capilar en gel, permite para el genotipado de alto rendimiento de clones knockout nucleasa mediada. Se evita limitaciones que enfrentan las otras técnicas de genotipificación y es más rentable que los métodos de secuenciación.

Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento

Los recientes avances en la capacidad de manipular genéticamente las líneas celulares somáticas tienen un gran potencial para la investigación básica y aplicada. En este sentido, presentamos dos enfoques para CRISPR / Cas9 generado producción de eliminación y el cribado en líneas de células de mamíferos, con y sin el uso de marcadores seleccionables.

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

Este protocolo describe el flujo de trabajo de un gen CRISPR/Cas9 basado en sistema para la reparación de las mutaciones de punto en células de mamíferos. Aquí, utilizamos un enfoque combinatorio gene edición con una detallado seguimiento estrategia experimental para medir la formación de indel en el sitio de destino, en esencia, analizar in situ la mutagénesis.

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Utilizando un Cas9 Confecciones complejo de ribonucleoproteína (RNP) es un método eficaz para la edición del genoma exacto, eficiente. Aquí, podemos destacar su utilidad en una amplia gama de células y organismos, incluyendo las células humanas primarias y ambos clásicos y emergentes en organismos modelo.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Aquí, presentamos un método para diseñar el genoma de C. elegans utilizando ribonucleoproteínas Cas9 CRISPR y plantillas de reparación dependiente de homología.

Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

CRISPR-Cas es una tecnología de gran alcance para los complejos genomas de plantas y animales. Aquí detallamos un protocolo eficiente editar el genoma humano utilizando diferentes endonucleasas de Cas. Se destacan importantes consideraciones y parámetros de diseño para optimizar la eficiencia de la edición.

Edición del genoma en las líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR-Cas

Aquí, presentamos un protocolo para optimizar CRISPR Cas9 para lograr una mayor especificidad sin la pérdida de actividad en el blanco. Utilizamos un enfoque de evolución dirigida llamado Sniper-pantalla para encontrar a un mutante Cas9 con las características deseadas. Sniper-Cas9 es compatible con truncado solo guía RNAs y entrega en un formato de ribonucleoproteína, conocidas estrategias para lograr mayor especificidad.

Uso de francotirador Cas9 para minimizar efectos Off-target de CRISPR Cas9 sin la pérdida de actividad en blanco mediante evolución dirigida

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

El objetivo de este protocolo es permitir la edición CRISPR/Cas9 sin fisuras del genoma de C. elegans utilizando complejos de ribonucleoproteína ensamblados y el marcador co-CRISPR dpy-10 para el cribado. Este protocolo se puede utilizar para realizar una variedad de modificaciones genéticas en C. elegans, incluidas inserciones, deleciones, reemplazos de genes y sustituciones de codones.

CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

Este estudio proporciona un procedimiento sistemáticamente optimizado de la construcción basada en ribonucleasa CRISPR / Cas9 de mutantes de langosta homocigota, así como un método detallado para la criopreservación y reanimación de los huevos de langosta.

Construcción de mutantes homocigotos de langostas migratorias utilizando tecnología CRISPR/Cas9

Un obstáculo importante para tecnologías como CRISPR son los eventos fuera del objetivo que pueden alterar genes vitales. La «circularización para la notificación in vitro de los efectos de la escisión mediante secuenciación» (CIRCLE-seq) es una técnica diseñada para identificar los sitios de escisión no intencionados. Este método mapea la actividad de CRISPR-Cas9 en todo el genoma con alta sensibilidad y sin sesgos.

CIRCLE-SEQ para la interrogación de la edición de genes fuera del objetivo

Aprende mutagénesis CRISPR-Cas sin cicatrices en bacteriófagos usando la enzima NgTET para reducir modificaciones del ADN. Este método mejora la ingeniería genética de fagos para aplicaciones en biotecnología y terapia fágica.

Mutagénesis precisa de fagos con sistemas CRISPR-Cas asistidos por NgTET

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