Medición del envejecimiento unicelular con un biomarcador basado en imágenes de la cromatina y el envejecimiento epigenético

Desarrollamos la cromatina basada en imágenes y la imagen epigenética de la edad, una técnica novedosa diseñada para cuantificar el envejecimiento y el rejuvenecimiento a resolución de una sola célula. Los relojes de metilación del ADN estiman la edad biológica, pero dependen de la regresión lineal, necesitan grandes cohortes y destruyen muestras, lo que los hace costosos e inadecuados para estudios a gran escala o longitudinales. Para empezar, transfiere los órganos y tejidos congelados a un mortero preenfriado colocado sobre hielo seco.

Vierte nitrógeno líquido sobre el tejido congelado y molédelo cuidadosamente con un mano de mano preenfriado hasta obtener un polvo uniformemente fino. Utilizando una espátula metálica preenfriada, alicuota el tejido molido en varios tubos. Después de extraer los núcleos, mézclalos con azul de tripáno en una proporción igual en un tubo separado.

Transfiere 10 microlitros de la mezcla a un hemocitómetro o cárgala en un contador celular automático. Introduce y verifica todos los metadatos, incluidos los identificadores de muestras, condiciones y biomarcadores en el mapa de placas y exporta un archivo CSV. Ahora, dispensar 10.000 núcleos por pozo en un volumen de 20 a 30 microlitros en una placa de 384 pozos.

Centrifuga la placa a 1000g, con la aceleración en el nueve y la desaceleración en cuatro, durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, fija los núcleos añadiendo un volumen igual de 8% de paraformaldehído y PBS, e incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el fijador, añade 30 microlitros de glicina molar de 0,1 molares en PBS e incuba durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Retira la solución de glicina y lava los pozos dos veces con 100 microlitros de PBS. Retira el PBS de cada pozo y añade 30 microlitros de solución bloqueante que contenga un 2% de BSA y un 0,5% de Triton X-100 en PBS. Incuba la placa durante una hora a temperatura ambiente.

Tras retirar la solución bloqueadora, incubar la muestra con 25 microlitros de solución primaria de anticuerpos a cuatro grados Celsius. Después, lava los pozos tres veces con 100 microlitros de PBS, cada lavado durando tres minutos a temperatura ambiente. Añade 25 microlitros de solución secundaria de anticuerpos e incuba durante dos horas a cuatro grados Celsius.

Luego, lava los pozos tres veces con 100 microlitros de PBS, cada lavado durando tres minutos a temperatura ambiente. Tinte los núcleos con DAPI o Hoechst añadiendo 30 microlitros del tinte a una concentración de 0,01 miligramos por mililitro, y lava la placa una vez con 100 microlitros de PBS para eliminar el exceso de colorante. Descarga los scripts de flujo de trabajo desde el repositorio de GitHub.

Una vez completada la descarga, descomprime el archivo para extraer su contenido. Organizar el repositorio de imágenes clonadas para que la estructura de carpetas coincida con el formato asumido por el flujo de trabajo para la ejecución correcta del script. Luego, abre la aplicación Terminal si funciona en Linux o Mac OS, o la aplicación WSL si usas Windows.

Cambia el directorio de trabajo a la carpeta del repositorio clonado escribiendo el comando requerido en el terminal y pulsando Enter. Crea un nuevo entorno computacional llamado Image_workflow usando Conda con Python versión 3.10 y pulsa Enter. Activa el entorno Conda recién creado con el comando conda activate Image_workflow.

Instala Poetry, un gestor de paquetes en Python, dentro del entorno activado usando el instalador PIP. Luego, instala todos los paquetes de Python necesarios para el flujo de trabajo usando Poetry. Ahora, configura CUDA dentro del entorno Conda para habilitar la funcionalidad de unidad de procesamiento gráfico durante el paso de segmentación.

Abre la aplicación Terminal y cambia la carpeta a la clonada. Activa el entorno Conda escribiendo el comando de abajo y pulsando Enter. Abre el archivo principal del flujo de trabajo en un editor de código o texto como VS Code o Notepad para configurar los parámetros de análisis.

Establece el nombre del proyecto asignando la variable p a un identificador corto de safe del sistema de archivos utilizado para organizar las salidas. Establece la lista de canales para la extracción de características en el chs, incluyendo el canal de segmentación si se requieren características de ese canal. Usando ImageIndex y la etiqueta del canal como clave, mapea el identificador de canal de imagen de los nombres de archivo al encabezado exacto de la columna del mapa de matrícula que se guarda antes.

Luego, establece ubicaciones de datos asignando orgDataLoadPath a la ruta del conjunto de datos, orgDataSubfolder a la subcarpeta de imagen si es necesario, y resultsSavePath a la ruta de salida. Confirma la extensión del nombre del archivo en imageFileFormat. Luego, edita imageFileRegEx para usar grupos de captura con nombre Python para las partes requeridas, incluyendo fila, columna, campo, posición Z y canal.

Ahora, configura el canal de segmentación en segmentation_ch al canal nuclear usado para la detección de objetos. Decide si usar la corrección de iluminación configurando una correctora de ilumiCorrection y ponla en verdadero para calcular y aplicar modelos básicos. Luego, establece el tamaño físico del vóxel en micrómetros en voxel_dim como ZYX usando metadatos del microscopio.

Guarda el archivo y cierra el editor tras verificar cada parámetro. Finalmente, ejecuta el script del flujo de trabajo para obtener lecturas de imágenes y realizar la validación, manteniendo el terminal abierto mientras el script está en ejecución. Visualiza los resultados y exporta las lecturas de imágenes en bruto para análisis adicionales en software externo.

Imágenes representativas de células madre pluripotentes inducidas mostraron núcleos claramente separados teñidos con DAPI, histona trimetilada H3 en lisina 27 e histona acetilada H3 en lisina 27. El análisis de imágenes de los músculos hepáticos y esqueléticos reveló una diferencia significativa entre muestras jóvenes y mayores, con ratones OSKM viejos mostrando menor imagen en comparación con los viejos, lo que indica una reprogramación parcial. El análisis de animales individuales indicó que algunas muestras antiguas de OSKM mostraron valores de imagen significativamente reducidos en comparación con ratones viejos.

Este protocolo permite a los investigadores investigar los cambios asociados a la edad en la organización de la cromatina y la epigenética a una sola resolución celular en diferentes tipos celulares y distintos tejidos. Nuestro método basado en imagen no es destructivo, preserva la estructura de la cromatina, permite mediciones repetidas y es más rentable en estudios a gran escala o longitudinales. Las futuras investigaciones se centrarán en añadir más marcadores epigenéticos y estudiar estructuras intranucleares relacionadas con el envejecimiento.