Modelado de la reparación alveolar pulmonar displásica y funcional después de la infección por influenza

Nuestra investigación se centra en mejorar la reparación pulmonar tras daños causados por infecciones o enfermedades crónicas. Estudiamos las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos del pulmón y que realizan el intercambio gaseoso. Los avances en las tecnologías de secuenciación de células únicas nos permiten identificar una heterogeneidad notable en los estados celulares pulmonares, incluyendo en enfermedades, pero aún no comprendemos completamente la función de estos estados celulares.

La infección intranasal es una inoculación técnica viral simple y no invasiva que sigue la raíz natural de la infección y permite el estudio tanto de la respuesta inmune adaptativa como innata contra el virus. La gripe sigue siendo prevalente a nivel mundial y causa enfermedades respiratorias graves. Por lo tanto, comprender la infección viral y la respuesta celular a la infección y la lesión tisular es fundamental para desarrollar tratamientos efectivos.

Para empezar, revisa la respiración del ratón anestesiado. Realiza un pellizco en el dedo del pie y observa la reacción. Procede solo si el ratón reacciona con una pequeña convulsión o salto sin mover la cabeza.

Utilizando una pipeta P200 ajustada a 50 microlitros, aspira el virus de la gripe A diluido del vial sobre hielo. Coloca la pipeta sobre una caja de punta o una toalla de papel, asegurándote de que la punta no toque los guantes ni la superficie del armario de bioseguridad. Ahora coge al ratón anestesiado con el cuello y sujeciónalo en posición vertical en un ángulo de 45 grados.

Mantén un agarre firme para alargar la tráquea y así inhalar mejor, asegurando que la respiración sea superficial y constante sin jadeos. Deja caer la dilución viral en las fosas nasales de forma a gota, alternando entre las fosas nasales para asegurar que el virus entre ambos lados de la nariz. Alternativamente, crea una burbuja de dilución viral que abarque ambas fosas nasales pipeteando lenta y de forma constante mientras el ratón inhala el líquido.

Sujeta la punta de la pipeta cerca del morro del ratón sin que la toque. Si el ratón empieza a despertarse, administra solo la mitad de la dosis. Tras administrar el virus de la gripe A, mantenga al ratón erguido durante uno o dos minutos para mantener abiertas las vías respiratorias y asegurar una administración eficaz a los pulmones.

Coloca suavemente un dedo a cada lado del pecho del ratón para detectar crujidos, lo que indica un avance exitoso en los pulmones. Cuando el ratón empiece a recuperarse, devólvelo a su jaula para que se recupere por completo. Vigila al ratón hasta que se vuelva ambulante.

Después de eutanasiar al ratón, disección la cavidad torácica para exponer la caja torácica y la tráquea. Abre el diafragma y sepáralo suavemente de la caja torácica sin perforar los pulmones. Luego corta a ambos lados de la caja torácica y sácalo por la parte superior.

Corta las clavículas y disecciona el hueso y el tejido blando circundante de la parte frontal de la tráquea. A continuación, disecciona el músculo y tejido que rodea la tráquea hasta que los anillos del cartílago sean claramente visibles sin perforar la tráquea. Usando pinzas curvas, empuja el esófago hacia fuera desde detrás de la tráquea y diseca completamente.

Luego pasa un trozo de sutura detrás de la tráquea y haz un nudo suelto. Corta un vaso sanguíneo grande y perfunde el sistema circulatorio inyectando lentamente DPBS a través del ventrículo derecho del corazón. Para inflar los pulmones para histologia o inmunofluorescencia, inflar los pulmones con paraformaldehído al 2% y deshidratar mediante una serie de etanol para la incrustación de parafina.

Para la inflación pulmonar con las manos, utiliza una jeringuilla y una aguja de calibre 21 a 23 con o sin tubo, o fija un tubo de paraformaldehído al 2% a un soporte de anillos situado a 30 centímetros sobre el banco para inflar por gravedad. Introduce la aguja en la parte superior de la tráquea con el bisel hacia arriba, teniendo cuidado de no perforar la parte inferior de la tráquea. Aprieta la sutura, no alrededor de la tráquea y la aguja, antes de introducir el fijador.

Para preparar una suspensión unicelular para citometría de flujo o secuenciación unicelular, se extrae el tejido pulmonar del DPBS y pícate con tijeras. Pica el pañuelo con una cuchilla de afeitar durante dos o tres minutos para obtener piezas de tamaño uniforme. Disociar el tejido en un buffer digestivo que contiene colagénasa uno, dispasa y DNasa en DPBS a 37 grados Celsius durante 30 a 35 minutos.

Luego filtra el tejido disociado a través de coladores celulares de 100 y 40 micrómetros. Lisa glóbulos rojos usando un tampón de lisis potásico con cloruro de amonio. Resuspende el pellet celular final en albúmina sérica bovina al 1% en PBS para su análisis posterior.

Los pulmones infectados por la gripe mostraron daños estructurales heterogéneos en comparación con los pulmones infectados simulados. La heterogeneidad tisular en pulmones infectados con gripe, cuantificada mediante un algoritmo de agrupamiento K-means, reveló múltiples agrupaciones espaciales. Los ratones infectados comenzaron a perder peso tres o cuatro días después de la infección, con un pico de pérdida de peso de aproximadamente un 25% que ocurrió entre ocho y diez días después de la infección.

A los 14 días de la infección, el peso corporal se había recuperado hasta situarse entre el 10 y el 15% del valor inicial. Debido a la variabilidad en la respuesta a la infección, las tasas de supervivencia entre los ratones infectados disminuyeron de forma constante, con algunos ratones sacrificados tras perder más del 30% de su peso corporal. Un estado celular endotelial estimulado por interferón apareció seis días después de la infección y se resolvió al día 19.

Mientras que un estado de células endoteliales capilares inducidas por lesión apareció en el día 11 y persistió durante un año después de la infección. El estado celular endotelial inducido por lesión capilar persistente se caracterizó por la expresión sostenida de la vía B y se observó un año después de la infección. Los estados celulares epiteliales alveolares transicionales, incluyendo las células alveolares inmaduras tipo uno, emergieron tras la infección y se resolvieron a medida que el tejido se reparaba.

Tras la infección, los macrófagos alveolares se agotaron y reconstituyeron tanto a partir de monocitos inflamatorios como de macrófagos restantes, lo que resultó en estados transcripcionales distintos que persistieron durante al menos un año.