Name: Aislamiento de ARN del epitelio del cristalino ocular de ratón y masas masivas de células de fibra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprenda a aislar ARN del epitelio y las células de fibra del cristalino ocular de ratón para análisis transcriptómico. Este método permite estudiar perfiles de expresión génica específicos de cada tipo celular.

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<ol><li>Lovicu, F. J., Robinson, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLovicu%2C+FJ+%22Development+of+the+Ocular+Lens%22">Development of the Ocular Lens</a>. , Cambridge University Press. (2004).</li>
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<li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+organelle+degradation+in+the+vertebrate+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of organelle degradation in the vertebrate lens.</a> Exp Eye Res. 88 (2), 133-139 (2009).</li>
<li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+the+Golgi+apparatus+and+the+endoplasmic+reticulum+during+lens+fiber+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The fate of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum during lens fiber cell differentiation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (9), 1793-1803 (1995).</li>
<li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+organelle+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Lens organelle degradation.</a> Exp Eye Res. 74 (1), 1-6 (2002).</li>
<li>Bassnett, S., Beebe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincident+loss+of+mitochondria+and+nuclei+during+lens+fiber+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Coincident loss of mitochondria and nuclei during lens fiber cell differentiation.</a> Dev Dyn. 194 (2), 85-93 (1992).</li>
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El cristalino ocular es un órgano transparente que enfoca finamente la luz en la retina para producir una imagen clara. El cristalino se compone de dos tipos principales de células: una monocapa de células epiteliales que cubren el hemisferio anterior y células de fibra que forman la masa a granel del tejido (Figura 1). El cristalino está envuelto por una membrana basal de colágeno conocida como cápsula del cristalino, a la que las células epiteliales están fuertemente adheridas. A medida que el cristalino crece, las células epiteliales en el ecuador proliferan y se diferencian en capas nacientes de células de fibra que se colocan en capas sobre el cristalinode manera concéntrica 1,2,3. El crecimiento del cristalino a lo largo de toda la vida depende de la proliferación continua de esta pequeña población de células epiteliales ecuatoriales que conforman la zona germinativa4. A medida que las células de fibra maduran, todos los orgánulos celulares se degradan para eliminar los objetos que dispersan la luz 5,6,7,8,9,10,11 y mantener la transparencia del tejido, y las células de fibra más internas finalmente se compactan, lo que da como resultado un centro de lente rígido 9,12. Debido a la cápsula del cristalino circundante, no hay renovación celular en el cristalino y las fibras seminales permanecen en el centro del cristalino durante toda la vida a medida que se agregan nuevas fibras en la periferia del tejido o la corteza. Las células de fibra del cristalino tienen diferentes propiedades ópticas dependiendo de su edad y pueden proporcionar una instantánea temporal de las diferentes características biológicas en cada etapa dada13.
A pesar de las opciones quirúrgicas disponibles, las cataratas, definidas como cualquier opacidad en el cristalino normalmente transparente, siguen siendo la principal causa de ceguera en el mundo14. Las cataratas pueden manifestarse en el epitelio, la corteza o el núcleo del cristalino con diferentes fisiopatologías15. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares de la formación de cataratas siguen sin estar claros16,17. Para comprender mejor cómo prevenir estos diferentes tipos de cataratas y desarrollar alternativas a la cirugía, debemos comprender mejor cómo estos diferentes tipos de células mantienen su homeostasis en el cristalino.
Las células epiteliales y de fibra desempeñan diferentes funciones fisiológicas en el cristalino. La proliferación celular, por ejemplo, está restringida al epitelio del cristalino18. Mientras tanto, las fibras de la lente comprenden la masa a granel de la lente, proporcionando estructura y propiedades refractivas a la lente9. Para obtener una perspectiva más matizada de los procesos biológicos involucrados en los diferentes compartimentos del cristalino, las células epiteliales y de fibra deben investigarse por separado. Aquí, presentamos un método para aislar el epitelio de la masa a granel de la célula de fibra, extraer ARNm de cada fracción y analizar estas transcripciones utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69079/69079fig1.jpg"> 
Figura 1: Diagrama de anatomía de la lente. El cristalino está compuesto por dos tipos de células, una monocapa de células epiteliales (azul y naranja) que cubre el hemisferio anterior y una masa a granel de fibras del cristalino (blanca). El tejido está rodeado por una fina membrana de colágeno, conocida como cápsula del cristalino (bronceado). Las células epiteliales anteriores (azul) están inactivas, mientras que las células epiteliales ecuatoriales (naranja) proliferan, se diferencian y se alargan para convertirse en nuevas capas de células de fibra (blancas) en la periferia del cristalino. Las nuevas generaciones de células de fibra se superponen a las generaciones anteriores de fibras en capas concéntricas. Las células de fibra del cristalino más antiguas se compactan en el centro del tejido. Esta cifra ha sido modificada de Cheng (2024)38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69079/69079fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Centrífuga y rotor</td><td>Fisher Scientific</td><td>14285554PM</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo, grado HPLC</td><td>Alfa Aesar</td><td>22920</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (190 grados)</td><td>Laboratorios de descontaminación</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200 grados)</td><td>Biorreactivos Fisher</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>Mortero de pellets Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-363</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Curvados; Pinzas para estudiantes #7</td><td>Instrumentos de precisión del mundo</td><td>501981</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Rectos; Dumont #5</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Rectos; Pinzas para estudiantes #4</td><td>Instrumentos de precisión del mundo</td><td>501978</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas Kim, pequeñas</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Limpieza de tareas delicadas</td></tr><tr><td>Aplicador de película adhesiva MicroAmp</td><td>Biosistemas aplicados</td><td>4333183</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp EnduraPlate Placa de reacción óptica de 96 pocillos con código de barras</td><td>Biosistemas aplicados</td><td>4483485</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 01-671-120</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio, Disección</td><td>Carl Zeiss</td><td>Descubrimiento de SteREO.V8</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta adhesiva óptica MiniAmp</td><td>Biosistemas aplicados</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador MiniAmp</td><td>Biosistemas aplicados</td><td>Referencia A37834</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice de placa MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>5353000529</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado molecular</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28191</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-UNO-W</td><td></td></tr><tr><td>Minibandejas Nunc MicroWell</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-154</td><td>Bandeja de disección</td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>VWR</td><td>201007-012</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, 1x Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta, 10 &micro; L Graduado</td><td>USA Científico</td><td>1161-3700</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta, 1250 &micro; L XL Graduado</td><td>USA Científico</td><td>1161-1720</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta, 200 &micro; Perfil L graduado</td><td>USA Científico</td><td>1163-1700</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3</td><td>Biosistemas aplicados</td><td>Referencia A28567</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa, SuperScript IV VILO&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11756050</td><td>Transcriptasa inversa altamente procesiva y termoestable</td></tr><tr><td>Kit de limpieza y concentrador de ARN 5</td><td>Zymo</td><td>ZR1013</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de ARNasa</td><td>Biorreactivos Fisher</td><td>BP2819</td><td></td></tr><tr><td>Aplicación de la Aplicación de la Enfermedad</td><td>Sigma</td><td>Referencia 2020</td><td>Solución de descontaminación de ARNasa</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga SealRite de 1,5 ml</td><td>USA Científico</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas SuperFine 8 cm</td><td>Instrumentos de precisión del mundo</td><td>501778</td><td>Tijeras</td></tr><tr><td>TaqMan FAST Advanced Master Mix para qPCR</td><td>Biosistemas aplicados</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de ensayo de expresión génica TaqMan (FAM) (MTO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4448892</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Solución de ácido-guanidinio-fenol</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880017</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de arn del epitelio del cristalino ocular de ratón y masas masivas de células de fibra

RNA Isolation from Mouse Ocular Lens Epithelium and Fiber Cell Bulk Masses

El epitelio y las fibras del cristalino se aislaron de ratones de tipo salvaje de 6 a 7 semanas de edad. Se utilizaron tres ratones para estos experimentos, y se agruparon 2 cápsulas de lentes o 2 masas de células de fibra de cada ratón para obtener una réplica biológica. Como se describe en el protocolo, el ARN se extrajo mediante la separación de fases de reactivos TRIzol. En promedio, un par de masas a granel de epitelio y fibra del cristalino produjeron 0,8 μg (DE ± 0,2) y 9,7 μg (DE ± 2,3) de ARN, respectivamente. L...

Aislamiento de ARN del epitelio del cristalino ocular de ratón y masas masivas de células de fibra

The lens is a specialized, transparent tissue in the anterior chamber of the eye that is comprised of two major cell types, epithelial cells and fiber ...

rna-isolation-from-mouse-ocular-lens-epithelium-fiber-cell-bulk

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí, describimos un protocolo para un microdissection de la captura del laser reproducible (LCM) para aislar la red trabecular (TM) para posteriores análisis de ARN. La capacidad de analizar los cambios en la expresión génica en el TM ayudarán en la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de enfermedades oculares relacionadas con la TM.

Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

La glándula lagrimal (LG) tiene dos tipos de células que expresan α-actina muscular lisa (αSMA): células mioepiteliales (MECs) y pericytes. Los MECs son de origen ectodérmico, se encuentran en muchos tejidos glandulares, mientras que los pericitos son células musculares lisas vasculares de origen endodérmico. Este protocolo aísla los MECs y los pericitos de los LGS murinos.

El aislamiento de las células mioepiteliales de la murina lagrimal adulta y las glándulas submandibulares

Este protocolo describe métodos para preparar células periféricas, maduras y nucleares de fibras del cristalino ocular para la tinción de inmunofluorescencia con el fin de estudiar las complejas interdigitaciones de célula a célula y la arquitectura de la membrana.

Preparación y tinción por inmunofluorescencia de haces y células de fibra única de la corteza y el núcleo del cristalino del ojo

Este manuscrito describe un protocolo de video detallado para el cultivo de células epiteliales del cristalino primario (LEC), con el objetivo de mejorar la reproducibilidad y ayudar a la investigación en cataratas y opacificación de la cápsula posterior (PCO). Ofrece instrucciones paso a paso sobre la disección de lentes, el aislamiento de LEC y la validación, lo que sirve como una guía valiosa, especialmente para los recién llegados al campo.

Optimización del cultivo de células epiteliales del cristalino primario de ratón: una guía completa para la tripsinización

Los protocolos actuales describen nuevas imágenes de montaje completo para la visualización de estructuras periféricas en el cristalino ocular con métodos para la cuantificación de imágenes. Estos protocolos se pueden utilizar en estudios para comprender mejor la relación entre las estructuras a microescala del cristalino y el desarrollo/función del cristalino.

Imágenes de montura completa para visualizar y cuantificar la estructura, la morfología y la organización de las lentes periféricas

Este manuscrito describe un protocolo detallado para aislar células de Müller gliales de la retina de ojos de ratón. El protocolo comienza con la enucleación y disección de los ojos de los ratones, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de las células de Müller.

Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Recientemente identificamos el endurecimiento capilar de la retina como un nuevo paradigma para la disfunción retiniana asociada con la diabetes. Este protocolo detalla los pasos para el aislamiento de los capilares de la retina del ratón y la matriz subendotelial de los cultivos endoteliales de la retina, seguido de una descripción de la técnica de medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica.

Aislamiento de capilares retinianos y matriz subendotelial de ratón para la medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica

La retina exhibe una organización espacial compleja a través de su estructura laminar. La transcriptómica espacial moderna y las técnicas de secuenciación requieren secciones de tejido &lt; 20 μm de grosor, lo que limita su aplicabilidad en la investigación de la retina. Este método de criosección recién congelada produce secciones delgadas en la cara de la retina del ratón al tiempo que preserva las relaciones espaciales planas, lo que permite un mapeo molecular completo a través de las...

En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

Aquí presentamos un protocolo para obtener suspensiones unicelulares de alta calidad de córneas completas de ratón mediante digestión secuencial con colagénasa A y tripsina. Este método produce células individuales viables con alta integridad de ARN, haciéndolas compatibles con aplicaciones posteriores como la secuenciación de ARN unicelular y el citometradory de flujo.

Un protocolo para la extracción de suspensión de célula única de córneas de ratón

Aprenda a aislar ARN del epitelio y las células de fibra del cristalino ocular de ratón para análisis transcriptómico. Este método permite estudiar perfiles de expresión génica específicos de cada tipo celular.

Aislamiento de ARN del epitelio del cristalino ocular de ratón y masas masivas de células de fibra

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