Generación de organoides cutáneos planos con cabello derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos mediante un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido
17 de octubre de 2025
Este protocolo describe un método para producir organoides cutáneos que contienen folículos pilosos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos utilizando un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido plano y fisiológicamente relevante para replicar la arquitectura y función de la piel.
El objetivo de mi investigación es intentar desarrollar un modelo de daño inducido por UVB para poder estudiar la patogenicidad de una enfermedad rara, la xeroderma pigmentosa, o más precisamente, XPA. Uno de los retos de estos modelos in vitro es que tardan bastante tiempo en cultivarse, aproximadamente cuatro meses, y dado que aún es un campo bastante joven, aún necesitamos caracterizarlos un poco mejor. Las ventajas de este modelo, así como el modelo 3D derivado de hiPSC, la cultura que hace que la interfaz aire-líquido recapitule la arquitectura de la piel humana y tiene un apéndice cutáneo como la glándula sebácea y los folículos pilosos.
Para empezar, prepara una solución de un molar añadiendo pellets de hidróxido de sodio a un tubo vacío de 15 mililitros. Añade agua destilada a los pellets y haz un vórtice en el tubo para disolverlos. Filtra la solución de hidróxido de sodio de 0,1 molares usando un filtro de membrana del tamaño de un poro de 0,2 micrómetros.
Sobre hielo, diluye la solución de colágeno tipo I con 10 veces PBS, hidróxido de sodio de cinco milimolares y agua destilada para ajustar el volumen final. Distribuye 150 microlitros de esta solución de colágeno en cada inserto, colocados en una placa estándar de 12 pozos. Incuba la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos para permitir que el gel de colágeno se polimerice.
Después, corta las puntas de P1000 con un bisturí calentado para crear puntas de gran calibre. Luego, utiliza las puntas anchas del orificio para colocar una estructura quística seleccionada con una pequeña cantidad de medio sobre la tapa de una placa de Petri de 10 centímetros. Elimina cuidadosamente cualquier subproducto de la estructura usando un bisturí estéril, mientras lo estabilizas con pinzas estériles en el lado opuesto.
Extrae aproximadamente un milímetro de ambos extremos de un organoide cutáneo quístico adyacente a la primera incisión usando un bisturí. Con pinzas estériles, despliega suavemente la capa superior de la piel. Corta el papel en dos o cuatro piezas, dependiendo del tamaño.
Luego, usando pinzas estériles, mueve cada pieza sobre un inserto recubierto de colágeno con la epidermis hacia arriba. Añade 600 microlitros de OMM a cada pozo de una placa estándar de 12 pozos. Transfiere el inserto de nuevo a la placa de 12 pozos que contiene OMM.
Luego coloca la placa en una incubadora a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono. Un único agregado celular denso que incorpora la mayoría de las células se formó al día cero mediante un manejo cuidadoso y centrifugación. Una inducción adecuada de la epidermia superficial llevó a la formación de un epitelio fino y claro en la capa externa del agregado al tercer día. Para el día 12, una fina capa de células mesenquimales se había acumulado en un polo del quiste.
Las placodas y clavijas capilares se hicieron visibles entre los días 50 y 80, tras la coinducción epitelial y mesenquimatosa. Los organoides sin placodos visibles mostraban un epitelio extremadamente delgado y se excluían de la transición planar. Solo se seleccionaron quistes de al menos cinco milímetros de diámetro con subproductos polarizados para la generación de organoides planos en la piel.
Los folículos pilosos se alargaron progresivamente durante los 27 días de cultivo de la interfaz aire-líquido. Las glándulas sebáceas se hicieron visibles alrededor del día 14 en la configuración plana. La pigmentación aumentó gradualmente en los organoides con el tiempo.
La tinción de hematoxilina y eosina reveló un epitelio estratificado y una membrana basal que lo separa de la dermis. La tinción por inmunofluorescencia confirmó la arquitectura similar a la piel humana en organoides cutáneos planos.
Descripción general
Este estudio desarrolla un modelo de daño inducido por UVB para investigar el xeroderma pigmentoso, centrándose en la generación de organoides dérmicos que incluyen folículos pilosos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas. Los organoides se cultivan utilizando una interfase aire-líquido fisiológicamente relevante para imitar eficazmente la arquitectura y función de la piel humana.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Patogenicidad de la xeroderma pigmentoso
- Desarrollo de modelos cutáneos in vitro
- Uso de la tecnología de organoides tridimensionales
Antecedentes
- Dificultades en el cultivo de organoides cutáneos
- Conocimiento actual de la biología de la piel
- Importancia de los folículos pilosos y las anexos cutáneos en la investigación
Métodos Utilizados
- Cultivo en interfase aire-líquido para el desarrollo de organoides
- Células madre pluripotentes inducidas humanas como fuente
- Técnicas de inmunofluorescencia y tinción histológica
Resultados principales
- Generación exitosa de organoides de piel con folículos pilosos
- Observación de la coinducción epidermal y mesenquimal
- Validación de la arquitectura similar a la piel humana mediante tinción
Conclusiones
- Este estudio proporciona información sobre el desarrollo de organoides cutáneos a partir de células madre.
- Demuestra el potencial de utilizar este modelo para comprender las enfermedades de la piel.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los organoides de piel con pelo derivados de iPSC humanas cultivados en la interfase aire-líquido proporcionan un sistema fisiológicamente relevante in vitro para investigar la biología de la piel y la formación de apéndices. Esta plataforma permite la modelización predictiva de las respuestas del tejido a agresiones ambientales y agentes farmacológicos, apoyando la investigación traslacional y la reducción mecanicista de riesgos en I+D dermatológica. El enfoque mejora la confianza en las carteras al permitir modelos de piel robustos y reproducibles para el descubrimiento temprano y la evaluación preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las interacciones intercelulares dentro de un microentorno cutáneo humano.
- Apoya la desestimación mecanicista mediante la modelización del desarrollo de apéndices y la estratificación del tejido.
- Facilita la validación funcional de dianas para vías relacionadas con la piel y mecanismos de enfermedades raras.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona una plataforma estandarizada y reproducible para la evaluación cuantitativa de las respuestas a fármacos y el daño tisular.
- Ofrece sistemas biológicos validados con folículos pilosos y glándulas sebáceas para la evaluación de compuestos.
- Permite la escalabilidad del ensayo y la reutilización de la plataforma para diversas aplicaciones en investigación cutánea.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Modela respuestas del tejido relevantes para la enfermedad, incluyendo daño inducido por UVB e infección por patógenos.
- Se alinea con estrategias traslacionales de biomarcadores mediante análisis molecular e histológico.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al conectar el descubrimiento con la validación preclínica.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
Este sistema de organoides integra desde el descubrimiento inicial hasta la investigación preclínica, permitiendo la comprobación de hipótesis, la clarificación de vías moleculares y el análisis predictivo en la biología de la piel.
- Biología del Descubrimiento: Apoya estudios basados en hipótesis sobre la arquitectura de la piel y la formación de apéndices.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para ensayos de respuesta a fármacos y daños.
- Análisis: Permite lecturas moleculares e histológicas para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traductiva: Facilita la continuidad desde la modelización in vitro hasta estudios preclínicos de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para múltiples iniciativas de investigación y selección cutánea.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación cutánea.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo estandarizados, escalables y reproducibles para la generación de organoides.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir modelos robustos in vitro.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos dermatológicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células madre, manipulación de organoides e ingeniería de tejidos.
- Exige acceso a instrumentación especializada para el cultivo en interfase aire-líquido y análisis molecular.
- Necesita la estandarización entre equipos de puntos de control de evaluación cualitativa y criterios de selección.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes modelos de enfermedad o tipos de tejido según el enfoque de la investigación.
- Los largos periodos de cultivo y la caracterización continua del campo son limitaciones prácticas a considerar.
