In Vitro Diferenciación residente de células T CD8 con memoria usando el sistema de cocultivo organoide-célula T epitelial

Nuestra investigación investiga las células T de memoria residentes del CD8 en el tracto reproductor femenino, examinando cómo las infecciones y enfermedades influyen en su residencia, función, mantenimiento y potencial terapéutico. Los métodos existentes limitan la supervivencia y la estabilidad fenotípica de las células T de memoria residentes. Este protocolo permite un estudio in vitro escalable induciendo la residencia tisular mediante cultivo de culto organoide de células T.

Para empezar, placar organoides epiteliales vaginales o VEOs a una densidad de 10.000 células en 20 microlitros de extracto de membrana basal por pozo de una placa de 24 pozos. Coloca la placa en la incubadora y conserva los cultivos durante siete a diez días a 37 grados Celsius. Un día antes del cocultivo, aspira el medio de cultivo celular de los pozos designados y lava los pozos con DPBS.

Aspira el DPBS y luego dispensa 600 microlitros de EDTA de tripsina al 0,25% precalentado en el pozo. Utilizando una pipeta P1000 recubierta con BSA, resuspende completamente para alterar mecánicamente el extracto de membrana basal y transfiere el contenido del pozo a un tubo cónico estéril de 15 mililitros recubierto con BSA. Ahora coloca el tubo cónico en un baño maria a 37 grados Celsius.

Después de cinco minutos, añade 10 mililitros de 10% de FBS en RPMI para calmar la tripsinización. Luego coloca el tubo en la centrífuga y gira a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y descarta el sobrenadante. Utilizando una punta de pipeta recubierta con BSA, resuspende el pellet en 100 a 300 microlitros de medio de cultivo de células T o DMEMF 12 simple.

Cuenta las células usando un hemocitómetro. Calcular el volumen de virus necesario para lograr una multiplicidad de infección de 0,1 utilizando el número total de células y el título viral conocido. Aspira el medio de cultivo celular de los pozos VEO seleccionados para la infección.

Lava cada pozo con 500 microlitros de DPBS precalentado y coloca la placa en una incubadora a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Tras cinco minutos, descarta el DPBS. Añade 500 microlitros de medio organoide que contenga suficientes partículas virales para lograr una multiplicidad de infección de 0,1.

Coloca el plato en una incubadora a 37 grados Celsius con dióxido de carbono al 5% durante una hora, girando suavemente el plato a mano cada 20 a 30 minutos. Transfiere la cantidad adecuada de extracto de membrana basal necesaria para el blindaje de menos 80 grados Celsius a cuatro grados Celsius y déjalo descongelarse durante ocho horas. Revisa los VEOs con un microscopio óptico para evaluar el tamaño y el estado general de salud.

Confirma que los VEOs tienen aproximadamente 100 micrómetros de diámetro, con una morfología redonda uniforme y un mínimo de células individuales. Aspirar el medio de cultivo celular de los pozos VEO y lavar cada pozo con 500 microlitros de DPBS estéril en frío mantenido entre dos y ocho grados Celsius. Tras retirar el DPBS, añade entre 200 y 500 microlitros de solución de extracción de organoides fríos a cada pozo, asegurando al menos un volumen 10 veces mayor que la gota de extracto de membrana basal.

Luego, usando una pipeta P200 recubierta con BSA, se interrumpe mecánicamente el extracto de membrana basal. Ahora coloca la placa sobre un agitador orbital ajustado a aproximadamente 100 revoluciones por minuto a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Tras la incubación, utiliza una punta de pipeta recubierta con BSA para mezclar y transferir el contenido de cada pozo a un tubo cónico estéril de 15 mililitros recubierto con BSA.

Coloca el tubo en la centrífuga y haz girar a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Luego descarta el sobrenadante. Lava el pellet VEO con cinco a diez mililitros de DPBS frío y centrifuga de nuevo a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Aspira el DPBS, luego utiliza una punta de pipeta P1000, vuelve a suspender el pellet en un mililitro de medio de cultivo de organoides de células T y coloca la suspensión VEO sobre hielo hasta que los lagrados T estén listos para el cocultivo. Para recoger células T, revisa las células T en reposo bajo un microscopio óptico para evaluar el tamaño y la salud general. Confirma que el lăbido T presenta cierto agrupamiento, morfología agrandada y no hay restos o fragmentos celulares visibles.

Utilizando una pipeta P1000, resuspende las células T pipeteando varias veces en cada esquina del pozo. Recoge un tubo cónico y cuenta el número total de células T vivas CD8. A continuación, coloca la suspensión de células T en la centrífuga y haz girar a 584 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Descarte el sobrenadante y resuspenda el pellet de células T en 10 mililitros de medio de cultivo de organoides de células T. Luego transfiere el número adecuado de células T al tubo cónico que contiene los VEOs previamente preparados para combinar las celdas. Coloque la suspensión combinada VEO y T-cell en la centrífuga y vuelva a girar a 584 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Tras descartar el sobrenadante, resuspende los VEOs y las células T en el volumen adecuado del extracto de membrana basal. Luego, usando otra punta de pipeta, coloca la suspensión sobre la placa de cultivo de tejidos precalentada, dispensando 20 microlitros por pozo para una placa de 24 pozos. Ahora invierte la placa de cultivo de tejido y colócala boca abajo en una incubadora a 37 grados Celsius.

Deja 30 minutos para la adhesión completa del extracto de membrana basal y solidificación. Tras el periodo de incubación, añade cuidadosamente el medio completo de cultivo de organoides de células T suplementado a cada pozo. Dispensar 500 microlitros por pozo para una placa de 24 pozos o 250 microlitros por pozo para una de 96 pozos, añadiendo el medio contra el lateral del pozo para evitar alterar la gota de extracto de membrana basal.

Cambiar el medio de cultivo cada dos días hasta que se recojan las muestras para el análisis de citometría de flujo. Los VEOs de ratón de siete días de antigüedad infectados con el virus de la coriomeningitis linfocítica que expresan proteína fluorescente amarilla mostraron abundante replicación viral tan pronto como cuatro horas después del cocultivo, visible como señales fluorescentes dentro de los organoides. La acumulación de células T CD8 cerca de organoides infectados se hizo prominente en momentos posteriores durante el cocultivo.

La agregación progresiva de células T CD8 se asoció con una reducción visible de la señal de proteína fluorescente amarilla en organoides infectados en momentos posteriores. Las células T CD8 cocultivadas con VEOs infectadas mostraron una expresión aumentada de CD 69 y CD 103 a lo largo del tiempo, lo que indica la adquisición de un fenotipo de memoria residente en el tejido. Los linfocitos T CD69 positivos y CD103 positivos y CD8 estimulados por antígenos mostraron un aumento significativo en la producción de interferón gamma e interleucina 2 intracelulares en comparación con los controles no estimulados.

Este protocolo permite el estudio in vitro de células T de memoria residentes en CD8, facilitando la manipulación eficiente de células epiteliales y T sin depender de modelos animales. El desafío más importante de este protocolo es mantener células T y organoides epiteliales vaginales sanos y viables, ya que la mala viabilidad o la infección comprometen la supervivencia en cocultivos y los resultados experimentales. Nos centramos en el análisis citométrico de flujo, pero se pueden recoger cocultivos para tinción, imagen y secuenciación.

El medio seguro permite ELISA aguas abajo.