Name: Shrinky-Dink colgante Gotas: Una manera sencilla de Forma y Cultura cuerpos embrioides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprende a formar cuerpos embrioides mediante microfabricación de pocillos con carga controlada de células madre embrionarias. Este método simplificado reduce el trabajo manual y mejora la reproducibilidad en biología de células madre.

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Nos gustaría dar las gracias al CIRM para apoyar este trabajo. La línea celular fue generosamente donada por el Dr. Andras Nagy en el Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario.

1. Hacer Shrinky Dink-Moho <ol><li> Imprimir el modelo deseado en la hoja de Shrinky-dink con una impresora buena definición. </li><li> Hornee Shrinky-dink hoja a 163 ° C durante unos 10 minutos, o hasta que esté completamente reducido y haber adquirido una forma regular. </li><li> Después de Shrinky-dink molde se haya enfriado, se sumergen en un baño de isopropanol hasta que la superficie total es de apenas cubiertos. </li><li> Cuidadosamente, rociar un poco de acetona sobre el molde y agitar contenedores un par de veces. Añadir más isopropanol para vaciar el exceso de acetona y repetir este paso varias veces hasta que Shrinky el molde se ve limpio. </li><li> Molde de sumergir en agua destilada durante 10 minutos para lavar cualquier resto de solvente orgánico. </li><li> Aire limpio Shrinky el molde. Volver a calentar durante unos 5 minutos a 163 ° C. Esto tinta compacta y evaporar cualquier solvente restante. </li></ol> 2. Hacer PDMS micropocillos <ol><li> Prepare una mezcla de agente de 10:01 PDMS / curado y agitar enérgicamente durante unos minutos. </li><li> Lugar Shrinky-dink molde en una pequeña placa de Petri. Vierta la mezcla de PDMS hasta llegar a aproximadamente 1 / 2 cm sobre la superficie del molde. </li><li> Introducir la cápsula en la campana de vacío para eliminar todas las burbujas de la mezcla de PDMS. </li><li> Introducir la cápsula en el horno a 70 ° C, durante la noche. </li><li> Cortar sólidos PDMS del molde y se unen a un portaobjetos de vidrio con sólo aplicar presión. </li><li> Primer descarte de micropocillos-chip, ya que cuenta con restos de tinta incrustada entre PDMS. </li><li> Repita este procedimiento para producir un segundo chip que está sin tinta y tiene una forma más definida. </li><li> Limpie micropocillos-chip con solución al 70% de etanol. Colócalo debajo de la fuente de luz UV durante 10 minutos para esterilizarlo. </li></ol> 3. Las células de trampeo en micropocillos <ol><li> Recuento de células y se diluye en medio de cultivo a la concentración deseada (dependiendo del número de células iniciales en los pozos que le gustaría). Por ejemplo, para obtener aproximadamente 10-15 células por pocillo (media = 11, SD = 5,4, la tasa de carga = 93%), se utilizó una concentración de 8 × 10 4 células / ml. Para una concentración de 17 × 10 4 células / ml, se podría obtener de forma fiable entre 25 y 35 células por pocillo (media = 27.17857 SD = 7,7, la tasa de carga = 100%). </li><li> Con cuidado, coloque chips pocillos en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene una base de PDMS solidificado. </li><li> Añadir alrededor de 2JDP ml de la solución de células. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 760 rpm y 4 ° C. </li><li> Pipeta de exceso de solución y lave cuidadosamente pocillos con PBS solución 1X. </li><li> Colocar en una placa de micropocillos Petry pequeño, con cuidado, teniendo el chip del tubo de centrífuga. </li><li> Lavar el exceso de células usando una solución de PBS X. </li><li> Lugar de chips de micropocillos bajo un microscopio invertido para verificar el número previsto de células por pocillo. </li><li> Incubar micropocillos que contienen las células en condiciones normales. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="Figura-01" width="350" height="183" /></li></ol> 4. Incubación de células <ol><li> Seguir el protocolo normal de EB en el laboratorio. </li><li> Cambiar el medio lentamente desde el lado de la cámara, no molestar a la celda de la microplaca. </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

Hemos desarrollado un método de cultivo sencillo, rápido y escalable para la carga de pre-definidos del número de células en los pozos microfabricated (moldeados a partir de Shrinky-Dinks) y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides. Por último, estas células son fácilmente accesibles para su posterior análisis y la experimentación. Este método se presta a cualquier laboratorio y no requiere equipo especializado, ya que elimina la necesidad de fotolitografía. Podemos variar el tamaño de las cúpulas, así como la concentración de...

Para los medios de comunicación MESC (McCloskey laboratorio protocolo): (por los medios de comunicación total preparado: 50ml, 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7,5 ml, 15 ml 1x Penn-estreptococo: 0.5 ml, 1 ml 2 mM L-glutamina: 0,5 ml, 1 ml AANE: 0.5 ml, 1 ml LIF: 100 ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50 ul, 100 ul diluido BME:. 50 ul, 100 ul (Agregar 35ul de BME filtrado estéril de 5 ml de PBS y filtro de jeringa de esterilizar Descartar después de 2 semanas. La concentración final en la solución es 0,1 mM)

shrinky-dink colgante gotas: una manera sencilla de forma y cultura cuerpos embrioides

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Cuerpos embrioides (EB) son agregados de células madre embrionarias. La forma más común de la creación de estos agregados es el método de la gota colgante, un enfoque laborioso de pipeteo un número arbitrario de las células en placas. Las interacciones entre las células madre obligado a cerca de uno al otro promueve la generación de la EBS. Debido a que los medios de comunicación en cada uno de los pozos tiene que ser intercambiados de forma manual todos los días, este enfoque es manual intensivo. Además, debido a los parámetros ambientales como la célula-célula, las células interacciones de los factores solubles, pH, y la disponibilidad de oxígeno pueden ser funciones del tamaño de EB, las poblaciones de células obtenidas a partir de gotas colgantes tradicionales pueden variar considerablemente, incluso cuando se cultivan en condiciones idénticas. Estudios recientes han demostrado claramente que el número inicial de células que forman el conjunto puede tener efectos significativos sobre la diferenciación de células madre. Hemos desarrollado un método de cultivo sencillo, rápido y escalable para la carga de pre-definidos del número de células en los pozos microfabricated y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides. Por último, estas células son fácilmente accesibles para su posterior análisis y la experimentación. Este método se presta a cualquier laboratorio y no requiere equipo especializado. Se demuestra que este método mediante la creación de cuerpos embrioides con una línea roja fluorescente de células de ratón (129S6B6-F1).

Nos muestran un método sencillo y rápido para cargar previamente definidos el número de células en los pozos microfabricated y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides.

Shrinky-Dink colgante Gotas: Una manera sencilla de Forma y Cultura cuerpos embrioides

Los cuerpos embrioides (EB, por sus siglas en inglés) son agregados de células madre embrionarias. La forma más común de crear estos agregados es el método de la gota suspendida, un proceso laborioso...

Los embrioblastos son agregados de células madre embrionarias. La forma más común de crear estos agregados es el método de la gota colgante. Un enfoque laborioso que consiste en pipetear un número arbitrario de células en placas de pocillos.El proceso requiere mucho trabajo manual porque el medio y cada placa de pocillos deben intercambiarse manualmente cada día. Además, estudios recientes han demostrado que el número inicial de células que forman el agregado puede influir en la diferenciación de las células madre. No existe ninguna manera de predefinir el número de células utilizando este método.En este video, mostramos un método sencillo y rápido para cargar diferentes cantidades de células en pozos microfabricados para el desarrollo de cuerpos bordados. Hola, soy Jonathan Pagan del laboratorio de Michelle K en la Escuela de Ingeniería de la Universidad de California en Merced, y soy Jesús Luna, también del laboratorio de K. Hoy les mostraremos un procedimiento para crear cuerpos bordados en pozos microfabricados mediante centrifugación.Este procedimiento incluye los siguientes pasos: crear un dispositivo microscópico, cargar las células madre y alimentar las células madre. Comencemos. El primer paso en este procedimiento consiste en fabricar el molde de shrinky dink utilizando una impresora de alta definición.Imprima el patrón deseado en hojas de shrinky dink. A continuación, hornee la hoja shrinky D a 160 grados Celsius durante aproximadamente 10 minutos o hasta que se haya encogido completamente y adquiera una forma regular. Después de que el molde de tinta encogida se haya enfriado durante dos minutos y esté frío al tacto.Súmérjalo en un baño de isopropanol hasta que la superficie completa esté apenas cubierta. Después de sumergir el molde de tinta retráctil en el isopropanol, rocíe cuidadosamente algo de acetona sobre el molde y agite el recipiente varias veces. Luego añada más isopropanol para eliminar el exceso de acetona y repita este paso varias veces hasta que el molde de tinta retráctil parezca limpio.A continuación, sumerja el molde y agua destilada durante 10 minutos para eliminar cualquier disolvente orgánico residual. Después de la inmersión en agua, seque el molde de tinta shrinky con aire comprimido y recaliente durante aproximadamente cinco minutos a 160 grados Celsius. Esto compactará la tinta y evaporará cualquier disolvente residual.Ahora podemos proceder a fabricar los micropozos de PDMS. Ahora generamos los micropozos de PDMS, que se utilizarán para cultivar las células madre para el desarrollo del embriónide. Prepare una mezcla de PDMS y agente de curado en una proporción de 10 a 1 y agite vigorosamente durante unos minutos.A continuación, vierta la mezcla de PDMS sobre el molde de shrinky dink en un pequeño plato de Petri hasta que alcance aproximadamente medio centímetro por encima de la superficie del molde. Después de verter el PDMS, a menudo se pueden observar burbujas sobre el molde, que deben eliminarse. Coloque el plato bajo una campana de vacío durante 20 minutos para eliminar todas las burbujas de la mezcla de PDMS.Después de asegurarse de que se han eliminado todas las burbujas, coloque la placa en el horno a siete grados Celsius durante 20 minutos. Tras la incubación, corte el PDMS sólido del molde con una cuchilla de afeitar. Límpielo utilizando cinta adhesiva y sujételo a una portaobjetos de vidrio con los pozos orientados hacia arriba.Esto se realiza simplemente aplicando presión sobre los bordes. A continuación, límpielo utilizando una solución de etanol al 70 % y colóquelo bajo una fuente de luz UV durante 10 minutos para esterilizarlo.La primera vez que haga esto, va a descartar el PDMS. Esto ayudará a eliminar cualquier residuo de tinta adicional de su molde. Puede usar el molde tal como está a partir de entonces.Repita el procedimiento de moldeo una vez más para producir un segundo chip libre de tinta y con una forma más definida. Asegúrese de aplicar una descarga durante 20 segundos antes de comenzar, para crear una superficie hidrofílica que facilite la carga. Después de fabricar los micropozos de PDMS, ya pueden utilizarse para el estudio de los cuerpos de Enid.Así que sigamos adelante. Para comenzar, las células deben contarse y diluirse en medio de cultivo celular hasta la concentración deseada, la cual depende del número de células iniciales que desee tener en cada pocillo. A una concentración de 1,5 veces 10 a la cuarta células por mililitro, observamos que se obtienen 14 células por pocillo cuando se cargan todos los pocillos.Agregue dos mililitros de solución celular a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga una base de PDMS solidificada. Coloque cuidadosamente el chip de micropozos en el tubo de centrífuga y centrifugue durante cinco minutos a 760 RPM. A continuación, aspire el medio con una pipeta y coloque el micropozo en una pequeña placa de Petri.Tenga cuidado de no derramar mientras saca el chip del tubo de centrífuga. A continuación, coloque el chip de pocillo microscópico bajo un microscopio invertido para verificar que cada pocillo esté cargado. Coloque el chip en el soporte e incube los micro pocillos que contienen células en condiciones estándar durante 24 horas.Para mantener las células, el medio puede cambiarse lentamente desde el lado de la cámara después de 24 horas. Evite perturbar las células en el micro. Puede hacer esto todos los días.Lo bueno es que se pipetea una sola vez y se cambia todo el medio, a diferencia de tener que cambiar el medio para cada pocillo en el método convencional de gotas colgantes. Acabamos de mostrarle cómo cultivar células y crear cuerpos de bordado a partir de moldes de shrinky dink. Este método es extremadamente útil porque es sencillo, rápido y manualmente menos intensivo que el método de gotas colgantes. Este método no requiere fotolitografía.Además, podemos controlar el número de células de las que partimos para crear nuestros cuerpos bordados. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

shrinky-dink-hanging-drops-simple-way-to-form-culture-embryoid

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este vídeo demuestra cómo llevar a cabo en la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón a cuerpos embrioides utilizando el método de gota.

En la diferenciación in vitro de la madre embrionarias de ratón (MES), las células con el método de gota

Se describe un método simple, rápido de generación de 3D, como los tejidos esferoides y su potencial aplicación para cuantificar las diferencias en las interacciones célula-célula.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Este video muestra un ensayo para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Las iPSC humanas son inducidas a formar cuerpos embrioides (EB). Las EB se cultivan sobre un andamio de polímero utilizando un medio de inducción, lo que promueve la diferenciación en células madre neurales, células progenitoras y neuronas inmaduras. Finalmente, los EB se incrustan en una matriz y se transfieren a un medio de mantenimiento para la formación de organoides...

Generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas

Este video muestra el proceso de generación de bolas de neuronas utilizando una técnica de cultivo de gota colgante. Dentro de las gotas colgantes, las células se mueven hacia la parte inferior, autoensambladas en estructuras tridimensionales que forman bolas de neuronas, que se pueden utilizar para estudios neurobiológicos.

Desarrollo de bolas de neuronas mediante una técnica de cultivo de gota colgante

El video demuestra la diferenciación de células madre embrionarias de ratón (mESCs) a cuerpos embrioides (EBs) por el método de gota colgante. Al suspender las mESC en gotas colgantes e incubarlas, las células se agregan para formar EB, que se diferencian aún más en células progenitoras neuronales (NPC) utilizando un medio de diferenciación suplementado con ácido retinoico (AR).

Generación de progenitores neurales a partir de células madre embrionarias de ratón mediante el método de la gota colgante

Este video muestra la utilización de una técnica de iluminación lateral de luz suave para mejorar la visualización a simple vista de cuerpos embrioides, facilitando así su manipulación y transferencia durante el cultivo de organoides cerebrales. Aclara la configuración de la iluminación de luz suave, los métodos para los cambios de medios y la transferencia de cuerpos embrioides, así como el procedimiento para inducir la diferenciación neuronal en los cuerpos embrioides para el desarrollo de...

Una técnica para optimizar el cultivo de organoides cerebrales mediante iluminación lateral con luz suave

El cultivo de gotas verticales ex vivo es una alternativa a las técnicas experimentales actuales in vitro e in vivo. Este protocolo es fácil de realizar y requiere cantidades más pequeñas de reactivo, a la vez que permite la capacidad de manipular y estudiar la vascularización, morfogénesis y organogénesis fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

Aquí describimos un protocolo para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo genera organoides renales en dos semanas. Los organoides renales resultantes se pueden cultivar en matraces giratorios a gran escala o placas de agitación magnética de múltiples pozos para enfoques paralelos de prueba de drogas.

Un método simplificado para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas

Los organoides cerebrales proporcionan oportunidades sin precedentes para estudiar el desarrollo de órganos y la patología de enfermedades humanas. Aunque se ha logrado un gran éxito con los sistemas de cultivo de organoides cerebrales, todavía existen dificultades operativas en la aplicación de esta tecnología. El presente protocolo describe un procedimiento organoide cerebral que facilita el cambio medio y la transferencia de organoides.

Facilitar el cultivo de organoides cerebrales a través de la iluminación lateral de luz suave

El presente protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para la generación, mantenimiento y envejecimiento reproducibles de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Este método permite cultivar y madurar organoides cerebrales durante períodos prolongados, lo que facilita el modelado de los procesos involucrados en el envejecimiento cerebral y la patogénesis relacionada con la edad.

Fabricación robusta de tejidos para el cultivo a largo plazo de organoides cerebrales derivados de iPSC para la investigación del envejecimiento

Aquí, presentamos un protocolo integral para la generación y el análisis posterior de organoides cerebrales humanos utilizando la secuenciación de ARN de una sola célula y un solo núcleo.

Generación y análisis posterior de transcriptomas de una sola célula y de un solo núcleo en organoides cerebrales

Aprende a formar cuerpos embrioides mediante microfabricación de pocillos con carga controlada de células madre embrionarias. Este método simplificado reduce el trabajo manual y mejora la reproducibilidad en biología de células madre.

Shrinky-Dink colgante Gotas: Una manera sencilla de Forma y Cultura cuerpos embrioides

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