Name: Shrinky-Dink colgante Gotas: Una manera sencilla de Forma y Cultura cuerpos embrioides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprende a formar cuerpos embrioides mediante microfabricación de pocillos con carga controlada de células madre embrionarias. Este método simplificado reduce el trabajo manual y mejora la reproducibilidad en biología de células madre.

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Nos gustaría dar las gracias al CIRM para apoyar este trabajo. La línea celular fue generosamente donada por el Dr. Andras Nagy en el Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario.

1. Hacer Shrinky Dink-Moho <ol><li> Imprimir el modelo deseado en la hoja de Shrinky-dink con una impresora buena definición. </li><li> Hornee Shrinky-dink hoja a 163 ° C durante unos 10 minutos, o hasta que esté completamente reducido y haber adquirido una forma regular. </li><li> Después de Shrinky-dink molde se haya enfriado, se sumergen en un baño de isopropanol hasta que la superficie total es de apenas cubiertos. </li><li> Cuidadosamente, rociar un poco de acetona sobre el molde y agitar contenedores un par de veces. Añadir más isopropanol para vaciar el exceso de acetona y repetir este paso varias veces hasta que Shrinky el molde se ve limpio. </li><li> Molde de sumergir en agua destilada durante 10 minutos para lavar cualquier resto de solvente orgánico. </li><li> Aire limpio Shrinky el molde. Volver a calentar durante unos 5 minutos a 163 ° C. Esto tinta compacta y evaporar cualquier solvente restante. </li></ol> 2. Hacer PDMS micropocillos <ol><li> Prepare una mezcla de agente de 10:01 PDMS / curado y agitar enérgicamente durante unos minutos. </li><li> Lugar Shrinky-dink molde en una pequeña placa de Petri. Vierta la mezcla de PDMS hasta llegar a aproximadamente 1 / 2 cm sobre la superficie del molde. </li><li> Introducir la cápsula en la campana de vacío para eliminar todas las burbujas de la mezcla de PDMS. </li><li> Introducir la cápsula en el horno a 70 ° C, durante la noche. </li><li> Cortar sólidos PDMS del molde y se unen a un portaobjetos de vidrio con sólo aplicar presión. </li><li> Primer descarte de micropocillos-chip, ya que cuenta con restos de tinta incrustada entre PDMS. </li><li> Repita este procedimiento para producir un segundo chip que está sin tinta y tiene una forma más definida. </li><li> Limpie micropocillos-chip con solución al 70% de etanol. Colócalo debajo de la fuente de luz UV durante 10 minutos para esterilizarlo. </li></ol> 3. Las células de trampeo en micropocillos <ol><li> Recuento de células y se diluye en medio de cultivo a la concentración deseada (dependiendo del número de células iniciales en los pozos que le gustaría). Por ejemplo, para obtener aproximadamente 10-15 células por pocillo (media = 11, SD = 5,4, la tasa de carga = 93%), se utilizó una concentración de 8 × 10 4 células / ml. Para una concentración de 17 × 10 4 células / ml, se podría obtener de forma fiable entre 25 y 35 células por pocillo (media = 27.17857 SD = 7,7, la tasa de carga = 100%). </li><li> Con cuidado, coloque chips pocillos en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene una base de PDMS solidificado. </li><li> Añadir alrededor de 2JDP ml de la solución de células. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 760 rpm y 4 ° C. </li><li> Pipeta de exceso de solución y lave cuidadosamente pocillos con PBS solución 1X. </li><li> Colocar en una placa de micropocillos Petry pequeño, con cuidado, teniendo el chip del tubo de centrífuga. </li><li> Lavar el exceso de células usando una solución de PBS X. </li><li> Lugar de chips de micropocillos bajo un microscopio invertido para verificar el número previsto de células por pocillo. </li><li> Incubar micropocillos que contienen las células en condiciones normales. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="Figura-01" width="350" height="183" /></li></ol> 4. Incubación de células <ol><li> Seguir el protocolo normal de EB en el laboratorio. </li><li> Cambiar el medio lentamente desde el lado de la cámara, no molestar a la celda de la microplaca. </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

Hemos desarrollado un método de cultivo sencillo, rápido y escalable para la carga de pre-definidos del número de células en los pozos microfabricated (moldeados a partir de Shrinky-Dinks) y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides. Por último, estas células son fácilmente accesibles para su posterior análisis y la experimentación. Este método se presta a cualquier laboratorio y no requiere equipo especializado, ya que elimina la necesidad de fotolitografía. Podemos variar el tamaño de las cúpulas, así como la concentración de...

Para los medios de comunicación MESC (McCloskey laboratorio protocolo): (por los medios de comunicación total preparado: 50ml, 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7,5 ml, 15 ml 1x Penn-estreptococo: 0.5 ml, 1 ml 2 mM L-glutamina: 0,5 ml, 1 ml AANE: 0.5 ml, 1 ml LIF: 100 ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50 ul, 100 ul diluido BME:. 50 ul, 100 ul (Agregar 35ul de BME filtrado estéril de 5 ml de PBS y filtro de jeringa de esterilizar Descartar después de 2 semanas. La concentración final en la solución es 0,1 mM)

shrinky-dink colgante gotas: una manera sencilla de forma y cultura cuerpos embrioides

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Cuerpos embrioides (EB) son agregados de células madre embrionarias. La forma más común de la creación de estos agregados es el método de la gota colgante, un enfoque laborioso de pipeteo un número arbitrario de las células en placas. Las interacciones entre las células madre obligado a cerca de uno al otro promueve la generación de la EBS. Debido a que los medios de comunicación en cada uno de los pozos tiene que ser intercambiados de forma manual todos los días, este enfoque es manual intensivo. Además, debido a los parámetros ambientales como la célula-célula, las células interacciones de los factores solubles, pH, y la disponibilidad de oxígeno pueden ser funciones del tamaño de EB, las poblaciones de células obtenidas a partir de gotas colgantes tradicionales pueden variar considerablemente, incluso cuando se cultivan en condiciones idénticas. Estudios recientes han demostrado claramente que el número inicial de células que forman el conjunto puede tener efectos significativos sobre la diferenciación de células madre. Hemos desarrollado un método de cultivo sencillo, rápido y escalable para la carga de pre-definidos del número de células en los pozos microfabricated y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides. Por último, estas células son fácilmente accesibles para su posterior análisis y la experimentación. Este método se presta a cualquier laboratorio y no requiere equipo especializado. Se demuestra que este método mediante la creación de cuerpos embrioides con una línea roja fluorescente de células de ratón (129S6B6-F1).

Nos muestran un método sencillo y rápido para cargar previamente definidos el número de células en los pozos microfabricated y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides.

Shrinky-Dink colgante Gotas: Una manera sencilla de Forma y Cultura cuerpos embrioides

Los cuerpos embrioides (EB, por sus siglas en inglés) son agregados de células madre embrionarias. La forma más común de crear estos agregados es el método de la gota suspendida, un proceso laborioso...

Los embrioblastos son agregados de células madre embrionarias. La forma más común de crear estos agregados es el método de la gota colgante. Un enfoque laborioso que consiste en pipetear un número arbitrario de células en placas de pocillos.El proceso requiere mucho trabajo manual porque el medio y cada placa de pocillos deben intercambiarse manualmente cada día. Además, estudios recientes han demostrado que el número inicial de células que forman el agregado puede influir en la diferenciación de las células madre. No existe ninguna manera de predefinir el número de células utilizando este método.En este video, mostramos un método sencillo y rápido para cargar diferentes cantidades de células en pozos microfabricados para el desarrollo de cuerpos bordados. Hola, soy Jonathan Pagan del laboratorio de Michelle K en la Escuela de Ingeniería de la Universidad de California en Merced, y soy Jesús Luna, también del laboratorio de K. Hoy les mostraremos un procedimiento para crear cuerpos bordados en pozos microfabricados mediante centrifugación.Este procedimiento incluye los siguientes pasos: crear un dispositivo microscópico, cargar las células madre y alimentar las células madre. Comen

shrinky-dink-hanging-drops-simple-way-to-form-culture-embryoid

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este vídeo demuestra cómo llevar a cabo en la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón a cuerpos embrioides utilizando el método de gota.

En la diferenciación in vitro de la madre embrionarias de ratón (MES), las células con el método de gota

Se describe un método simple, rápido de generación de 3D, como los tejidos esferoides y su potencial aplicación para cuantificar las diferencias en las interacciones célula-célula.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Este video muestra un ensayo para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Las iPSC humanas son inducidas a formar cuerpos embrioides (EB). Las EB se cultivan sobre un andamio de polímero utilizando un medio de inducción, lo que promueve la diferenciación en células madre neurales, células progenitoras y neuronas inmaduras. Finalmente, los EB se incrustan en una matriz y se transfieren a un medio de mantenimiento para la formación de organoides...

Generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas

Este video muestra el proceso de generación de bolas de neuronas utilizando una técnica de cultivo de gota colgante. Dentro de las gotas colgantes, las células se mueven hacia la parte inferior, autoensambladas en estructuras tridimensionales que forman bolas de neuronas, que se pueden utilizar para estudios neurobiológicos.

Desarrollo de bolas de neuronas mediante una técnica de cultivo de gota colgante

El video demuestra la diferenciación de células madre embrionarias de ratón (mESCs) a cuerpos embrioides (EBs) por el método de gota colgante. Al suspender las mESC en gotas colgantes e incubarlas, las células se agregan para formar EB, que se diferencian aún más en células progenitoras neuronales (NPC) utilizando un medio de diferenciación suplementado con ácido retinoico (AR).

Generación de progenitores neurales a partir de células madre embrionarias de ratón mediante el método de la gota colgante

Este video muestra el proceso de diferenciación de cuerpos embrioides (EBs) en agregados neuroepiteliales y su posterior división en células neuronales y gliales. Este método permite la generación eficiente de células neuronales y gliales in vitro, que sirven como sistemas de ensayo para las pruebas de toxicidad, así como para la evaluación de diferentes vías implicadas en la neurotoxicidad.

Generación de neuronas y células gliales a partir de cuerpos embrioides derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

Este video muestra la utilización de una técnica de iluminación lateral de luz suave para mejorar la visualización a simple vista de cuerpos embrioides, facilitando así su manipulación y transferencia durante el cultivo de organoides cerebrales. Aclara la configuración de la iluminación de luz suave, los métodos para los cambios de medios y la transferencia de cuerpos embrioides, así como el procedimiento para inducir la diferenciación neuronal en los cuerpos embrioides para el desarrollo de...

Una técnica para optimizar el cultivo de organoides cerebrales mediante iluminación lateral con luz suave

El cultivo de gotas verticales ex vivo es una alternativa a las técnicas experimentales actuales in vitro e in vivo. Este protocolo es fácil de realizar y requiere cantidades más pequeñas de reactivo, a la vez que permite la capacidad de manipular y estudiar la vascularización, morfogénesis y organogénesis fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

Se describe una técnica para el uso de células madre embrionarias murinas para generar dos o tres cuerpos embrioides dimensionales. A continuación, explicamos cómo inducir la diferenciación neural de las células del cuerpo embrioides por ácido retinoico, y cómo analizar su estado de diferenciación de células progenitoras por inmunofluorescencia marcador e inmunotransferencia.

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Aquí describimos un protocolo para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo genera organoides renales en dos semanas. Los organoides renales resultantes se pueden cultivar en matraces giratorios a gran escala o placas de agitación magnética de múltiples pozos para enfoques paralelos de prueba de drogas.

Un método simplificado para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas

Aquí, presentamos un protocolo integral para la generación y el análisis posterior de organoides cerebrales humanos utilizando la secuenciación de ARN de una sola célula y un solo núcleo.

Generación y análisis posterior de transcriptomas de una sola célula y de un solo núcleo en organoides cerebrales

Aprende a formar cuerpos embrioides mediante microfabricación de pocillos con carga controlada de células madre embrionarias. Este método simplificado reduce el trabajo manual y mejora la reproducibilidad en biología de células madre.

Shrinky-Dink colgante Gotas: Una manera sencilla de Forma y Cultura cuerpos embrioides

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