Shrinky-Dink colgante Gotas: Una manera sencilla de Forma y Cultura cuerpos embrioides

Los cuerpos embroides son agregados de células madre embrionarias. La forma más común de crear estos agregados es el método de caída colgante. Un enfoque laborioso de pipeteo, un número arbitrario de células en placas de pocillos.

El proceso es manual intensivo porque los medios y cada placa de pocillo deben cambiarse manualmente todos los días. Además, estudios recientes han demostrado que el número inicial de células que forman el agregado puede tener efectos sobre la diferenciación de las células madre. No hay forma de predeterminar el número de celdas utilizando este método.

En este video, mostramos una forma de cargar de manera simple y rápida diferentes números de células en micro pozos fabricados para el desarrollo del cuerpo de los embroides. Hola, soy Jonathan Pagan del laboratorio de Michelle K en la Escuela de Ingeniería de la Universidad de California Merced, y soy un Jesús Luna también del laboratorio Ks. Hoy te mostraremos un procedimiento para crear cuerpos embroidales y micro pozos fabricados por centrífuga.

Este procedimiento implica los siguientes pasos, crear un microdispositivo, cargar las células madre y alimentar las células madre. Así que comencemos. El primer paso en este procedimiento es hacer el molde de tinta retráctil utilizando una impresora de buena definición.

Imprima el patrón deseado en hojas de dink retráctiles. A continuación, hornee la hoja D retráctil a 160 grados centígrados durante unos 10 minutos o hasta que se haya encogido por completo y haya adquirido una forma regular. Después de que el molde de tinta se haya enfriado durante dos minutos y se enfríe al tacto.

Sumérgelo en un baño de isopropanol hasta que la superficie completa esté apenas cubierta. Después de que el molde de tinta retráctil se haya sumergido en el isopropanol, rocíe con cuidado un poco de acetona sobre el molde y agite el recipiente varias veces. Luego agregue más isopropanol para lavar el exceso de acetona y repita este paso varias veces hasta que el molde de tinta retráctil se vea limpio.

A continuación, sumerja el molde y el agua destilada durante 10 minutos para eliminar los disolventes orgánicos restantes. Después de nuestra inmersión en agua, el aire limpió el molde de tinta retráctil con aire comprimido y lo recalentó durante unos cinco minutos a 160 grados centígrados. Esto compactará la tinta y evaporará cualquier solvente restante.

Y ahora podemos proceder a hacer los micropocillos PDMS ahora. Ahora generamos los micropocillos de PDMS, que se utilizarán para cultivar las células madre para el desarrollo del cuerpo de los embroides. Prepare una mezcla de PDMS a agente de curado de 10 a uno y agite vigorosamente durante unos minutos.

A continuación, vierta la mezcla de PDMS sobre el molde de dink retráctil en una pequeña placa de Petri hasta que alcance aproximadamente medio centímetro sobre la superficie del molde. Después de verter el PDMS, a menudo se pueden observar burbujas sobre el molde para eliminarlas. Coloque el plato bajo una campana de vacío durante 20 minutos para eliminar todas las burbujas de la mezcla de PDMS.

Después de asegurarse de que se hayan eliminado todas las burbujas, coloque el plato en el horno a siete grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, corte el PDMS sólido del molde con una cuchilla de afeitar. Límpialo con cinta adhesiva y átalo a un portaobjetos de vidrio con los pocillos hacia arriba.

Esto se hace simplemente aplicando presión a los bordes. A continuación, límpialo con una solución de etanol al 70% y colócalo bajo una fuente de luz UV durante 10 minutos. Para esterilizarlo.

La primera vez que hagas esto, vas a descartar el PDMS. Esto ayudará a eliminar cualquier residuo de tinta adicional del molde. Puede usar el molde tal cual a partir de entonces.

Repita el procedimiento de moldeo una vez más para producir un segundo chip que no tenga tinta y una forma más definida. Asegúrese de hacer una descarga actual durante 20 segundos antes de comenzar a crear una superficie hidrófila para facilitar la carga. Después de fabricar los micropocillos PMS, ahora se pueden utilizar para el estudio de los cuerpos de Enid.

Así que vamos a proceder. Para comenzar, las células deben contarse y diluirse en medios de cultivo celular hasta la concentración deseada, que depende de la cantidad de células iniciales en los pocillos que desee. A 1,5 por 10 a la cuarta celda por mililitro, descubrimos que se obtienen 14 celdas por pocillo con cada pocillo cargado.

Agregue dos mililitros de solución celular a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga una base de PDMS solidificada. Coloque con cuidado el micro chip de pocillo en la centrífuga del tubo de centrífuga durante cinco minutos a 760 RPM. A continuación, pipetee los medios y coloque el micropocillo en una pequeña placa de Petri.

Tenga cuidado de no derramar mientras saca el chip del tubo de la centrífuga. A continuación, coloque el microchip del pocillo bajo un microscopio invertido para verificar que todos los pocillos estén cargados. Coloque el chip en el soporte e incube los micropocillos que contienen celdas en condiciones estándar durante 24 horas.

Para mantener las células, el medio se puede cambiar lentamente desde el lado de la cámara después de 24 horas. Evite perturbar las células en el micro. Bueno, puedes hacer esto todos los días.

Lo bueno es que pipetea una vez e intercambia todos los medios en lugar de tener que cambiar los medios de cada pocillo, por gotas colgantes convencionales, Acabamos de mostrarle cómo cultivar células y crear cuerpos embrómicos a partir de moldes de dink retráctiles. Este método es extremadamente útil porque es simple, rápido y manual, menos intensivo que el método de caída colgante. Este método no requiere fotolitografía.

Además, podemos controlar el número de células a partir de las cuales iniciamos nuestros cuerpos embroides. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.