Un modelo de ratón neonatal de enterocolitis necrotizante y aislamiento de lámina propia para el perfil de células inmunitarias

Nuestra investigación se centra en la enfermedad que afecta a los bebés médicamente frágiles llamada enterocolitis necrotizante. Nuestro objetivo es descubrir los mecanismos implicados en la respuesta inmunitaria en la NEC y desarrollar estrategias para el diagnóstico y prevención precoz de la enfermedad. Es muy difícil estudiar las respuestas de las células inmunitarias intestinales en la NEC neonatal. Nuestro protocolo cubre esta carencia demostrando cómo aislar células inmunes de lámina propia para su análisis mediante citometría de flujo.

Para empezar, adquiere un cultivo de bacterias entéricas de un bebé con enterocolitis total necrotizante, o NEC. En el día experimental 0 a las 15:00, se pipete una alcuota de 20 microlitros del cultivo en un tubo de cultivo de 15 mililitros que contiene 2 mililitros de caldo Luria-Bertani. Incubar el cultivo bacteriano a 37 grados Celsius durante 16 horas en un agitador orbital ajustado a 1G, asegurando que la tapa del tubo se mantenga en posición de ventilación.

Al mismo tiempo, incubar un segundo tubo de cultivo que contenga solo 2 mililitros de caldo Luria-Bertani como control para comprobar si hay contaminación. Al día siguiente, a las 7:00 de la mañana, pipote 125 microlitros del cultivo bacteriano nocturno en un matraz de cultivo de células T75 con tapa ventilada que contiene 25 mililitros de caldo Luria-Bertani. Prepara un total de cuatro matrazas T75 e incuba en posición vertical a 37 grados Celsius durante dos horas en un agitador orbital ajustado a 1G.

A las 9:00 de la mañana en los días experimentales 1, 2 y 3, combina 16 mililitros de fórmula infantil con 8 mililitros de leche de cachorro en un tubo centrífugo estéril de 50 mililitros para preparar la mezcla de fórmula. Retirar el sobrenadante de dos tubos centrifugadores de 50 mililitros que contienen el cultivo bacteriano en pelota. Resuspende completamente cada uno de los dos pellets en 2 mililitros de la mezcla de fórmula preparada.

Luego transfiere ambas mezclas resuspendidas a la mezcla de fórmula restante para crear un total de 24 mililitros de fórmula NEC. Etiqueta seis tubos de centrifugación de 50 mililitros con los seis puntos de tiempo de alimentación. Pipetea 4 mililitros de la fórmula NEC en cada uno de los seis tubos etiquetados.

A continuación, prepare seis alicotas de un solo uso de base de lipopolisacáridos a 5 miligramos por mililitro y almacene en microtubos de baja unión a 20 grados Celsius. Justo antes de alimentar, descongela una alicota de lipopolisacáridos y usa el vórtice durante 15 segundos. Añade un volumen calculado del lipopolisacárido a un tubo de fórmula NEC de 4 mililitros y mezcla bien pipeteando.

Llena una jeringuilla de 1 mililitro con la fórmula NEC preparada y conéctala a una línea PICC neonatal. Para administrar la fórmula NEC a cada cachorro mediante un mando oral, sujeta suavemente al cachorro por la piel flácida en la base del cuello y mantenlo erguido. La distancia de inserción de la línea PICC es igual a la distancia desde la comisura de la boca hasta la parte superior de la zona de leche en el estómago.

El punto óptimo de inserción en la línea PICC debe marcarse con un rotulador permanente. Con pinzas, guía la línea PICC hacia el orofaringe y hacia abajo hasta el estómago. Si se encuentra resistencia, retirar la línea PICC, recolocarla e intentar reinsertarla.

Dispensa lentamente 80 microlitros de fórmula NEC en el estómago. Vigila al cachorro en busca de signos de aspiración durante la alimentación. Después de alimentar, retira la línea PICC y observa al cachorro para detectar cualquier respiración dificultosa o vómitos.

Si se produce regurgitación, seca la boca y la nariz del cachorro con una toallita de laboratorio con baja pelusa. Repite el proceso de alimentación en todos los momentos de la comida. En el día experimental 4, obtener tejido intestinal de ratones neonatales eutanasiados.

Con unas tijeras, corta el intestino longitudinalmente para abrirlo y luego sepáralo transversalmente en segmentos de 1 a 1,5 centímetros. Transfiere los segmentos intestinales a un tubo centrífugo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de solución predigestiva que ha sido refrigerada sobre hielo. Luego incubar el tubo a 37 grados Celsius con rotación continua durante 20 minutos para comenzar la disociación del tejido.

Gira suavemente el tubo para desalojar el tejido suelto y luego vierte el contenido a través de un colador de celdas de 100 micrómetros colocado sobre un tubo centrífugo de 50 mililitros. Transfiere los fragmentos de tejido restantes a un nuevo tubo centrífuga de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de solución digestiva precalentada a 37 grados Celsius. Incuba la muestra con rotación continua durante 40 minutos a 37 grados Celsius.

Luego transfiere el contenido a un tubo automatizado de disociación tisular. Ejecuta el programa con cuatro ciclos de rotación alternados de 15 segundos en sentido horario y antihorario. Cuando la disociación esté completa, se centrifuga suavemente la suspensión celular en el tubo de disociación y luego centrifuga a 300G durante 5 minutos a 4 grados Celsius.

Aspira cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet. Resuspende las células en 1 mililitro de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia helado. Coloca un colador de celda de 100 micrómetros sobre un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Transfiere las células resuspendidas por el colador y lávatela con 2 mililitros de tampón de clasificación de células activado por fluorescencia fría. Cuenta las células aisladas y evalúa la viabilidad usando azul de tripán o un colorante de viabilidad. Centrifuga el volumen deseado para la citometría de flujo a 300G durante 5 minutos a 4 grados Celsius.

Se observó una reducción significativa en la supervivencia en el grupo de tratamiento con NEC en comparación con los controles alimentados con la presa. El examen intestinal macroscópico de ratones con NEC mostró características distintivas de la NEC, incluyendo signos visibles de distensión, acumulación de aire y neumatosis intestinal en comparación con los controles sanos. La tinción por hematoxilina y eosina reveló destrucción vilosa y fragmentada y una arquitectura intestinal alterada en ratones NEC en comparación con las vellosidades intactas en los controles.

La expresión de ARN mensajero IL1B, CXCL2 y LCN2 fue significativamente mayor en el grupo NEC que en los controles. Las células inmunitarias CD45+ totales en la lámina propia intestinal no difirieron significativamente entre los grupos NEC y control. Los niveles de macrófagos estaban significativamente elevados en los intestinos NEC en comparación con los controles.

Los ratones NEC mostraron una proporción aumentada de células mieloides, particularmente monocitos y macrófagos, en comparación con otros subtipos inmunes. Los enfoques multiómicos de célula única están descubriendo firmas celulares inmunitarias en la NEC, ofreciendo nuevas perspectivas sobre los mecanismos y posibles biomarcadores. Modelar la NEC es complicado porque la enfermedad es multifactorial.

Replicar el entorno intestinal humano, las respuestas inmunitarias y las influencias microbianas en ratones neonatales requiere una optimización cuidadosa. Nuestro modelo integra microbioma de origen humano, hipoxia y alimentación con fórmula, lo que lo hace fisiológicamente relevante y alineado para un perfilado detallado de células inmunitarias en ratones neonatales.