Imágenes de células vivas del transporte endocítico utilizando nanocuerpos funcionalizados en células cultivadas

Estamos estudiando el tráfico endocítico y retrógrado de las proteínas transmembrana, así como la maquinaria que confiere el transporte. Para investigar el tráfico de proteínas desde la superficie celular, normalmente se utilizan anticuerpos convencionales, aunque podrían promover la reticulación cruzada y la dirección lisosomal. Para empezar, obtén una pelota de bacterias Escherichia coli transformada con VHH-mCherry.

Añadir 30 mililitros de tampón de unión con frío hielado que contiene 20 milimolares de imidazol en PBS al pellet de células bacterianas. Con una pipeta, resuspende bien el pellet pipeteando arriba y abajo. Transfiere la mezcla resuspendida a un tubo centrifugador de 50 mililitros etiquetado.

Suplementar las células resuspendidas con 200 microgramos por mililitro de lisozima, 20 microgramos por mililitro de DNasa I, un cloruro de magnesio milimolar y un milimolar fenilmetilsulfonilfluoruro. Después de incubar el tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos, colócalo sobre un rotador extremo sobre extremo y continúa la incubación a cuatro grados Celsius durante una hora. A continuación, inserta una punta sólida de sonda de seis milímetros del sonicador directamente en la suspensión de la celda.

Altera mecánicamente las células bacterianas mediante tres pulsos de sonicación de un minuto con amplitud del 40% y un ciclo de trabajo de un segundo encendido y un segundo apagado. Permitiendo un intervalo de enfriamiento de un minuto entre cada pulso. Tras la centrifugación, mantener el lisato despejado sobre hielo mientras se prepara para la cromatografía de afinidad metálica inmovilizada utilizando columnas de purificación de etiquetas preenvasadas y de un solo uso, diseñadas para operación por flujo gravitatorio.

Fija las columnas de ácido níquel-nitrilotriacético sobre un soporte metálico o un soporte de columna adecuado. Luego vacía completamente el buffer de almacenamiento de la columna. Equilibrar la columna añadiendo 10 mililitros de tampón de unión que contiene 20 milimolares de imidazol en PBS.

Deja que el buffer pase por gravedad. Aplicar gradualmente aproximadamente 30 mililitros del lisato bacteriano eliminado a la columna equilibrada. Deja que pase por gravedad y descarta el flujo a través de él.

Luego lava la columna aplicando dos volúmenes consecutivos de 10 mililitros de tampón de unión que contenga 20 milimolares de imidazol en PBS. Eluir los nanocuerpos unidos aplicando dos mililitros de buffer de elución que contenga 500 milimolares imidazol en PBS en un tubo microcentrífuga de dos mililitros. Equilibrar una columna de desalación sembrada en un adaptador de tubo de 50 mililitros enjuagando cinco veces con cinco mililitros de PBS.

Deja que el buffer entre completamente en la resina empaquetada y luego descarta el flujo a través. Tras el enjuague final, centrifuga la columna a 1000 x g durante dos minutos. Ahora mueve la columna con su adaptador a un nuevo tubo de recogida de 50 mililitros tras descartar el flujo.

Cargar dos mililitros del nanocuerpo funcionalizado eluído sobre la columna de desalación pre-equilibrada. Luego centrifugar de nuevo a 1000 x g durante dos minutos para recoger el eluato antes de validar la expresión y pureza de VHH-mCherry. Inicia el software del sistema automatizado de imagen de células vivas.

Transfiere la cámara de microscopía ibidi al escenario del microscopio. Configura dos canales de imagen usando filtros de excitación y emisión para EGFP y mCherry. Elige un tiempo de exposición corto y una intensidad de iluminación baja para evitar el blanqueamiento fotográfico.

Mantén los ajustes constantes para todos los experimentos. La configuración puede variar entre periodistas. Para cada condición, almacena las coordenadas de 10 campos de visión diferentes que contienen de tres a cuatro celdas enfocadas en una lista de puntos.

Luego captura una única instantánea de cada posición en la lista de puntos para que sirva como imagen de referencia antes de añadir VHH-mCherry. Para iniciar la endocitosis, añadir suavemente 350 microlitros de solución precalentada de VHH-mCherry a cada pozo, minimizando la perturbación en la monocapa. Luego procede a la adquisición de imágenes.

Realizar una adquisición en lapso de tiempo para 100 fotogramas en intervalos 32 manteniendo 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Para analizar la captación endocítica de VHH-mCherry, carga los conjuntos de imágenes en time-lapse en el software de análisis de imágenes. Aplica herramientas de segmentación y seguimiento para cuantificar la fluorescencia internalizada a lo largo del tiempo en diferentes regiones de interés.

Todas las variantes funcionales de nanocuerpos se purificaron a alto rendimiento y pureza, mostrando solo VHH-mCherry una degradación proteolítica menor. Los productos de degradación de VHH-mCherry se confirmaron como dominios individuales de VHH-mCherry mediante detección de inmunoblot específica de epítopo. En ausencia de BirA, se recuperó VHH-mCherry a aproximadamente 20 miligramos por preparación.

Y la biotinilación fue confirmada por la extracción de estreptavidina agarosa de mezclas de nanocuerpos BSA. Las proteínas de fusión marcadas con EGFP expresadas en células HeLa mostraron patrones de localización subcelulares consistentes con sus homólogos endógenos, incluyendo la localización perinuclear de EGFP-CDMPR y EGFP-CIMPR. Localización perinuclear exclusiva de EGFP-TGN46 y localización periférica de TfR-EGFP.

VHH-mCherry permitió la visualización de células vivas del transporte endocítico de EGFP-CDMPR, mostrando un aumento de la colocalización durante 60 minutos. La captación de VHH-mCherry en células que expresan EGFP-CDMPR alcanzó un estancamiento tras aproximadamente 43 minutos, con una vida media de nueve minutos. En células que expresan TfR-EGFP, VHH-mCherry se acumuló rápidamente intercelularmente con una vida media de cuatro minutos y saturación tras 20 minutos.

Hemos establecido un kit de herramientas versátil basado en nanocuerpos para analizar el transporte de cualquier proteína transmembrana desde la superficie celular. Utilizamos nanocuerpos fluorescentes para marcar proteínas de carga superficial y luego estudiamos su tráfico endocítico mediante microscopía de células vivas. Con nuestro enfoque de imagen de células vivas basado en nanocuerpos, queremos descubrir vías que impulsen el transporte de carga de la superficie a la red trans-Golgi.