Name: Imágenes de células vivas del transporte endocítico utilizando nanocuerpos funcionalizados en células cultivadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprende a visualizar el transporte endocítico en células HeLa mediante nanocuerpos VHH-mCherry funcionalizados. Este método permite cuantificar la dinámica de proteínas transmembrana en tiempo real.

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<table><tbody><tr><td>Anticuerpo anti-GFP y nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>El producto se distribuye por Sigma-Aldrich, pero es fabricado por Roche</td></tr><tr><td>Platos de cultivo celular de 100 mm</td><td>TPP</td><td>TPP93100</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo antiactina</td><td>EMD Milliporo&nbsp;</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-HA</td><td>Del laboratorio</td><td>fabricado a partir de 12CA5 híbrido</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-His6</td><td>Laboratorios Bethyl & nbsp;</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-T7 y nbsp;</td><td>Laboratorios Bethyl & nbsp;</td><td>A190-117A</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competente y E. coli</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrato de cloruro de calcio</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>disuelto en agua estéril, el stock mide 1 M</td></tr><tr><td>Carbenicilina sal desódica</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>disuelto en agua estéril, el caldo es de 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Coomassie-R (Azul Brillante)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>D-biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>disuelto en 500 mM NaH2PO4 o DMSO</td></tr><tr><td>Columnas desechables PD10 para desalar</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX-I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosa alta, sin glutamina, sin fenol rojo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>disuelto en agua estéril</td></tr><tr><td>Dulbecco' s solución salina tamponada con fosfato (DPBS) sin Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S, PES, Porengr&ouml; &szlig; e: 0,45 y micro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección FuGENE HD</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Cubiertas de cristal (Nº 1.5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>HRP anti-ratón de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>HRP anti-conejo de cabras</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>Su kit de amortiguamiento</td><td>Cytvia</td><td>11003400</td><td></td></tr><tr><td>Sus columnas en GraviTrap</td><td>Cytvia</td><td>11003399</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Slide 4 well, ibiTreat</td><td>80426-IBI</td><td>Ibidi</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil-&beta;-D-tiogalactopiranoside (IPTG)</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>disuelto en agua estéril, el stock mide 1 M</td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>disuelto en agua estéril, el caldo es de 100 mg/mL</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima y lisozima;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>El producto se distribuye por Sigma-Aldrich, pero es fabricado por Roche</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidrato</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>disuelto en agua estéril, el stock mide 1 M</td></tr><tr><td>Geles Mini-Protean TGX, 4-20%, 15-pocillos</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>HeLa Kyoto modificado</td><td>Del laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB5-alpha Competent&nbsp;E. coli</td><td>NEB</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 preparaciones</td><td>Macherey-Nagel&nbsp;</td><td>740412.1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Bioconcept&nbsp;</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>disuelto en DMSO al 60% isopropanol, material en 500 mM</td></tr><tr><td>Línea celular Phoenix ampho</td><td>Laboratorio Nolan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polibrena (bromuro de hexadimetrina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invivogen</td><td>ANT-PR-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio y nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>disuelto en agua estéril, el caldo mide 5 m</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio y nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Pack, mini</td><td>Bio-Rad</td><td>1704158</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura y nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de células vivas del transporte endocítico utilizando nanocuerpos funcionalizados en células cultivadas

Live-cell Imaging of Endocytic Transport using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Imágenes de células vivas del transporte endocítico utilizando nanocuerpos funcionalizados en células cultivadas

Endocytosis of receptors and other transmembrane proteins from the cell surface to endosomes and beyond is critical for homeostasis, physiology, and ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Imágenes de células vivas es de particular utilidad en el estudio de la dinámica del tráfico de orgánulos. A continuación se describe un protocolo para obtener imágenes en vivo de alta densidad de núcleo vesículas en las neuronas cultivadas con amplio campo de la microscopía de fluorescencia. Este protocolo es flexible y puede adaptarse a los orgánulos de imagen como las mitocondrias, endosomas, y peroxisomas.

Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas

Fuente: Zhang, Y., et al. Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar la remodelación del sistema endolisosomal por bacterias intracelulares. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el uso de nanopartículas fluorescentes para visualizar la remodelación endo-lisosomal en células epiteliales humanas infectadas por bacterias intracelulares. Después de la invasión bacteriana, los patógenos manipulan el citoesqueleto del huésped y el sistema endolisosomal, formando vacuolas con...

Visualización mediada por nanopartículas de la remodelación endolisosomal en células infectadas por bacterias

Este video muestra un método para estudiar la absorción y el transporte retrógrado de nanocuerpos funcionalizados para comprender sus vías de tráfico intracelular. Mediante la introducción de sulfato radiomarcado y la utilización de técnicas de aislamiento y detección, este método permite el estudio de la absorción endocítica y la llegada de proteínas de carga a través de la red trans-Golgi.

Monitorización de la llegada de proteínas de superficie marcadas con GFP a la red Trans-Golgi utilizando nanocuerpos funcionalizados

Este video demuestra cómo las vesículas neuronales se marcan con proteínas fluorescentes específicas para visualizar su movimiento. Primero, un plásmido que codifica para una proteína fluorescente se incuba con un agente de transfección y luego se introduce en un cultivo de neuronas. Posteriormente, se adquieren imágenes de las neuronas y se analizan para rastrear el movimiento de las vesículas.

Visualización de las motilidades de las vesículas en las neuronas mediante imágenes de fluorescencia

Se describen los métodos de formación de imágenes que utilizamos para investigar la distribución y la movilidad de las proteínas fluorescentes transfectadas residentes en el retículo endoplásmico (RE) por medio de la imagen confocal de células vivas. También analizamos ultraestructuralmente el efecto de su expresión en la arquitectura de este compartimento subcelular.

Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

Se describe un método para etiquetar proteína en la superficie de neuronas vivas usando un anticuerpo policlonal específico para epítopos extracelulares. La proteína unida por el anticuerpo en la superficie celular y, posteriormente, internalizado a través de la endocitosis se puede distinguir de la proteína restante en, o de trata a, la superficie durante la incubación.

Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

Este artículo describe métodos para la síntesis y marcaje fluorescente de nanopartículas (NPs). Los NPs se aplicaron en los experimentos de pulso-caza para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal por las actividades del patógeno intracelular Salmonella enterica fueron seguidos por imágenes de células vivas y cuantificada.

Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares

Proyección de imagen de células vivas es una poderosa herramienta para visualizar procesos dinámicos. El examen de las células fijas proporciona sólo imágenes estáticas, que pueden conducir a malas interpretaciones y confusión sobre el proceso. Este trabajo presenta un método para estudiar la absorción, liberación de fármaco y localización intracelular de la nanopartículas en las células vivas.

Usando In Vitro células vivas imágenes para explorar quimioterápicos entregado por nanopartículas basadas en lípidos

La investigación del tráfico de membranas es crucial para entender las funciones neuronales. Aquí, se introduce un método para la cuantificación de la motilidad vesicular en las neuronas. Este es un método conveniente que puede adaptarse a la cuantificación del tráfico de membranas en el sistema nervioso.

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

Transporte retrógrado de proteínas de la superficie de la célula al Golgi es esencial para mantener la homeostasis de la membrana. Aquí, describimos un método para analizar bioquímicamente transporte de superficie de Golgi de la célula de proteínas recombinantes utilizando nanobodies funcionalizados en células HeLa.

Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados

Aprende a visualizar el transporte endocítico en células HeLa mediante nanocuerpos VHH-mCherry funcionalizados. Este método permite cuantificar la dinámica de proteínas transmembrana en tiempo real.

Imágenes de células vivas del transporte endocítico utilizando nanocuerpos funcionalizados en células cultivadas

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