Ingeniería epigenética de células K562: estrategia episomal de doble vector para la metilación estable del ADN dirigida utilizando proteínas de fusión dCas9-DNMT3A y -HDAC1

Nuestra investigación tiene como objetivo desarrollar un sistema estable y no integrado para la metilación dirigida del ADN, explorando la edición epigenética duradera en células K562. Los avances recientes en el campo incluyen sistemas CRISPR-dCas9 de doble efector, que combinan enzimas epigenéticas para una modificación epigenética sinérgica, estable y específica localmente. Para empezar, mantener las células K562 en matrazas de cultivo T75 a 37 grados Celsius con condiciones de 5% de dióxido de carbono y humedad.

Cuantifique el ADN episomal que se usará para la transfección utilizando un espectrofotómetro a 260 nanómetros. Utiliza ocho microgramos de ADN total de plásmidos por transfección preparando cuatro microgramos de cada plásmido para una co-transfección, y mezcla la cantidad requerida con 90 microlitros de agua ultrapura. Ahora, añade 10 microlitros de solución de acetato de sodio 3 molares y 2,5 volúmenes de etanol al 100% a la solución de ADN diluido.

Mezcla bien la solución de ADN e incubala durante la noche a 20 grados Celsius para permitir la precipitación del ADN. Al día siguiente, centrifugar el tubo de precipitación de ADN a 11.000 G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. En condiciones estériles, en un armario de bioseguridad, descarta cuidadosamente el sobrenadante del tubo.

Añade 500 microlitros de etanol al 70% al tubo para lavar el pellet, y centrifuga de nuevo a 11.000 g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, retira completamente el sobrenadante de etanol del tubo y deja que el bolíto de ADN se seque al aire hasta que no quede etanol visible. Luego, resuspende bien la pelota de ADN seca en 50 microlitros de DMEM.

Conserva 400 nanogramos del ADN resuspendido aproximadamente 2,5 microlitros en un tubo nuevo, y almacena la solución plasmida DMEM a cuatro grados Celsius hasta su uso adicional. Analizar la muestra restante de ADN en un gel al 1%agarosa para verificar la purificación e integridad del ADN. Extrae las células de K562 de un matraz T75 cuando los cultivos alcancen una confluencia del 50 al 60% para asegurar una eficiencia óptima de transfección.

Cuenta las células extraídas usando un hemocitómetro y transfiere un volumen que contenga dos veces 10 a la potencia de cinco células a una placa de cultivo de 35 milímetros que contenga 900 microlitros de DMEM sin FBS ni antibióticos. Coloca la taja de cultivo en una incubadora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono para mantener las células listas para la transfección. Utiliza un kit de transfección a base de lipofectamina para administrar los plásmidos siguiendo las instrucciones del fabricante y ajustando los volúmenes si es necesario.

Añade tres microlitros de reactivo P3000 a la solución plásmidica DMEM previamente preparada. Mezcla suavemente y deja la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos. Ahora, añade cinco microlitros de reactivo Lipofectamina 3000 junto con suficiente DMEM para alcanzar un volumen final de 100 microlitros.

Incuba esta mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 15 minutos. Añade los 100 microlitros completos de la mezcla de transfección al plato de cultivo de 35 milímetros que contiene las células. Sacude suavemente el plato para dispersar la mezcla de forma uniforme y luego vuelve a colocarlo en la incubadora.

A las 24 horas de la transfección, añadir tres mililitros de DMEM de medio completo suplementados con 10% de FBS y una vez penicilina estreptomicina a cada recipiente para promover la proliferación de células transfectadas. A las 72 horas de la transfección, comienza la selección añadiendo el antibiótico G418 para alcanzar una concentración final de un miligramo por mililitro. Una vez establecido el proceso de selección y el recuento total de células supera uno por 10 hasta la potencia de seis, se extraen las células por centrifugación a 300 G durante seis minutos a 25 grados Celsius.

Lava el pellet una vez con PBS estéril único, pH aproximadamente 7,4, y centrifuga de nuevo bajo las mismas condiciones. Tras volver a suspender el pellet celular final en PBS una vez, determina la concentración celular usando un hemocitómetro. Diluir la suspensión a uno por 10 a la potencia de seis células por mililitro, asegurando que las células estén completamente resuspendidas, y transfiere las células a un tubo de citometría de flujo.

A continuación, montar el clasificador celular activado por fluorescencia en modo celular único utilizando una placa tratada con cultivo de tejidos de 96 pozos como dispositivo de recogida. Ajusta la configuración del software según el instrumento que utilices. Bloquear la población primaria seleccionando celdas basándose en la dispersión directa y lateral para aislar el tamaño y la granularidad esperados.

Excluye los residuos y las células muy granulares o muertas, y utiliza el área de dispersión hacia adelante frente a la altura o el área de dispersión lateral frente a la altura para los singlets de compuertas. Luego, pre-llena cada pozo de la placa de 96 pozos con 100 microlitros de medio completo que contenga un miligramo por mililitro de G418, y calienta la placa en una incubadora a 37 grados Celsius. Realizar la clasificación de celdas en modo de celda única, manteniendo la tasa de ordenación por debajo de 300 eventos por segundo para mejorar la precisión.

Tras la clasificación, inspecciona cada pozo bajo un microscopio para confirmar la presencia de una sola célula por pozo y coloca la placa en una incubadora a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono. Permitir que los clones de célula única se expandan individualmente en la placa de 96 pozos. Una vez que el crecimiento clonal es evidente, se añade un medio que contenga G418 reducido a los pozos hasta una concentración final de 400 microgramos por mililitro para mantener la presión selectiva.

Transfiere clones bien desarrollados secuencialmente a placas de 12 pozos, luego a matrazas T25 y, finalmente, a matrazas T75 según sea necesario hasta que cada clon alcance aproximadamente uno por 10 a la potencia de seis celdas. Después, recoge pellets de doble célula a intervalos regulares. Guarda un pellet a menos 20 grados Celsius para la extracción de ADN genómico.

Homogeneizar un segundo pellet en 500 microlitros de reactivo de TRIzol y almacenarlo a menos 20 grados Celsius para la extracción de ARN y la síntesis complementaria de ADN. Extraer ADN genómico de clones seleccionados mediante extracción de fenol-cloroformo seguida de precipitación con etanol. Resuspender completamente el ADN extraído en agua libre de nucleasas o en un tampón TE.

Mide la concentración y pureza del ADN usando un espectrofotómetro antes de continuar con los pasos posteriores. Finalmente, extraer ARN total de los pellets celulares almacenados usando reactivo TRIzol, seguido de precipitación con isopropanol. Las células individuales se clasificaron en placas de 96 pozos utilizando la selección de células activada por fluorescencia para aislar las que portaban ambos constructos.

El análisis PCR de 10 clones expandidos confirmó que solo algunos conservaban ambos constructos, indicados por bandas en 230 pares de bases y 205 pares de bases. La pirosecuenciación reveló que el clon dos positivo mostró una metilación aumentada en múltiples sitios de CPG cerca de la región objetivo de gRNA1 en comparación con el control no transfectado. Abordamos la falta de sistemas de entrega a largo plazo no integrados, permitiendo una edición epigenética precisa y estable sin alterar el genoma del huésped.

Nuestros hallazgos establecen una herramienta fiable para estudiar la regulación génica mediante la metilación de la diana, y apoyan el desarrollo de posibles terapias epigenéticas precisas. Investigaciones futuras explorarán la mejora de la administración episómica, la minimización de los efectos objetivo, la mejora de la eficiencia de Cas9 y la adaptación del sistema para modelos primarios o in vivo.