Name: Ingeniería epigenética de células K562: estrategia episomal de doble vector para la metilación estable del ADN dirigida utilizando proteínas de fusión dCas9-DNMT3A y -HDAC1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprenda a realizar edición epigenética dirigida en células K562 utilizando un sistema CRISPR/dCas9 episomal con efectores dCas9-DNMT3A y dCas9-HDAC1. Este método permite metilación estable del ADN con precisión y efectos fuera del objetivo reducidos.

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<ol><li>Firdaus, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+explorations+of+neurological+disorders%2C+the+identification+methods%2C+and+therapeutic+avenues%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic explorations of neurological disorders, the identification methods, and therapeutic avenues.</a> Int J Mol Sci. 25 (21), 11658(2024).</li>
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<li>Nuñez, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+programmable+transcriptional+memory+by+CRISPR-based+epigenome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing.</a> Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).</li>
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<li>Hofacker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+effector+domains+for+targeted+DNA+methylation+with+reduced+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering of effector domains for targeted DNA methylation with reduced off-target effects.</a> Int J Mol Sci. 21 (2), 502(2020).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiCas-DL%3A+predicting+sgRNA+activity+for+CRISPR-mediated+epigenome+editing+by+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">EpiCas-DL: predicting sgRNA activity for CRISPR-mediated epigenome editing by deep learning.</a> Comput Struct Biotechnol J. 21, 202-211 (2023).</li>
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<li>Batra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+the+effect+of+CRISPR-Cas9-based+epigenome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Predicting the effect of CRISPR-Cas9-based epigenome editing.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Stavrou, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episomal+vectors+based+on+S%2FMAR+and+the+%CE%B2-globin+replicator%2C+encoding+a+synthetic+transcriptional+activator%2C+mediate+efficient+%CE%B3-globin+activation+in+haematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Episomal vectors based on S/MAR and the β-globin replicator, encoding a synthetic transcriptional activator, mediate efficient γ-globin activation in haematopoietic cells.</a> Sci Rep. 9 (1), 19765(2019).</li>
<li>Stavrou, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B2-globin+replicator+greatly+enhances+the+potential+of+S%2FMAR+based+episomal+vectors+for+gene+transfer+into+human+haematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The β-globin replicator greatly enhances the potential of S/MAR based episomal vectors for gene transfer into human haematopoietic progenitor cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 40673(2017).</li>
<li>Hagedorn, C., Antoniou, M. N., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+cis-acting+sequences+improve+expression+and+establishment+of+a+nonviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Genomic cis-acting sequences improve expression and establishment of a nonviral vector.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 2 (8), e118(2013).</li>
<li>Stehle, I. M., Rupprecht, S., Cremer, T., Jackson, D. A., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+mitotic+stability+of+an+extra-chromosomal+mammalian+replicon%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment and mitotic stability of an extra-chromosomal mammalian replicon.</a> BMC Cell Biol. 8, 33(2007).</li>
<li>Lufino, M. M. P., Manservigi, R., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+S%2FMAR-based+infectious+episomal+genomic+DNA+expression+vector+provides+long-term+regulated+functional+complementation+of+LDLR+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An S/MAR-based infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-term regulated functional complementation of LDLR deficiency.</a> Nucleic Acids Res. 35 (15), e98(2007).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
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<table><tbody><tr><td>Mezcla digital PCR Absolute Q DNA (5x)</td><td>Biosistemas Aplicados</td><td>A52490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI-HF&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R3552</td><td></td></tr><tr><td>ASCI</td><td>NEB</td><td>R0558</td><td></td></tr><tr><td>AseI</td><td>NEB</td><td>R0526</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador de celdas melódicas BD FACS</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bglll</td><td>NEB</td><td>R0144</td><td></td></tr><tr><td>BspEI</td><td>NEB</td><td>R0540</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (10 mM cada una)</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glucosa alta con glutamina estable, con medio piruvato de sodio</td><td>Biowest</td><td>L0103</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa I, fragmento grande (de Klenow)</td><td>NEB</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>DNMT3A (CD), secuencias HDAC1</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA Polimerasa&nbsp;</td><td>Termo Científica</td><td>EP0712</td><td></td></tr><tr><td>EpiTect</td><td>Qiagen</td><td>59104</td><td>Kit de conversión de bisulfito &nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de bisulfito Epitect</td><td>Qiagen</td><td>59104</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>NEB</td><td>R0734</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico selectivo de genética (G418 sulfato)</td><td>Gibco</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transfección Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>NEB&reg; &nbsp; 5-alfa Competente &nbsp;E. coli&nbsp; (Alta eficiencia)</td><td>NEB</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NEB&reg; &nbsp; 5-alfa F'Iq&nbsp; Competent&nbsp;E. coli&nbsp; (Alta eficiencia)</td><td>NEB</td><td>C2992H</td><td></td></tr><tr><td>Tejido nucleoespín/nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.50</td><td></td></tr><tr><td>PBS, solución 10x pH 7,4</td><td>Lonza</td><td>BE17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>Vector pGuide</td><td>OriGene Technologies</td><td>GE100042</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico 25:24:1 Saturado con 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Cebadores, sgRNAs y nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseño de ensayo PyroMark &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>Versión 2.0</td><td>Herramienta de diseño de cebador de bisulfito&nbsp;</td></tr><tr><td>Reactivos PyroMark Gold Q24</td><td>Qiagen</td><td>970802</td><td></td></tr><tr><td>Kit de PCR PyroMark &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 MDx</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Estación de trabajo de pirosecuenciación&nbsp;</td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Software&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>v2.0.8</td><td>Software de pirosecuenciación &nbsp;</td></tr><tr><td>Q5&reg; ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>NEB</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>Kit de placas QuantStudio Absolute Q MAP16</td><td>Biosistemas Aplicados</td><td>A52865</td><td>Sistema de PCR digital &nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain, concentrado 10.000x en DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Ligasa de ADN T4</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleótido quinasa T4</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

ingeniería epigenética de células k562: estrategia episomal de doble vector para la metilación estable del adn dirigida utilizando proteínas de fusión dcas9-dnmt3a y -hdac1

Epigenetic Engineering of K562 Cells: Dual-Vector Episomal Strategy for Stable Targeted DNA Methylation using dCas9-DNMT3A and -HDAC1 Fusion Proteins

Ingeniería epigenética de células K562: estrategia episomal de doble vector para la metilación estable del ADN dirigida utilizando proteínas de fusión dCas9-DNMT3A y -HDAC1

Investigating the precise role of DNA methylation in gene transcriptional regulation and developing therapies targeting specific gene methylation patterns ...

epigenetic-engineering-k562-cells-dual-vector-episomal-strategy-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Aquí se describe un protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de sangre periférica mediante una estrategia basada en la reprogramación episoma y los inhibidores de la histona deacetilasa.

Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

Describimos en detalle dos protocolos basados en químicos para el cultivo de células madre embrionarias de ratón. Este nuevo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidación mediada por Tet (vitamina C) y reprimiendo la síntesis de novo de la 5-METILCITOSINA (por PD0325901) para mantener el hypomethylation de la DNA y pluripotencia de células madre embrionarias de ratón.

Un método de cultura alternativa para mantener la hipometilación genómica de células madre embrionarias del ratón usando MEK inhibidor PD0325901 y vitamina C

Protocolos detallados para la introducción de una enzima de la división ingeniería-TET2 (sidra) en células de mamífero para químicas inducible hydroxymethylation de ADN y remodelación epigenéticos se presentan.

División ingeniería-TET2 enzima ADN químico-inducible Hydroxymethylation y remodelación epigenéticos

Reglamento de medio ambiente de la cromatina es un proceso esencial para expresión génica adecuada. Aquí, describimos un método para controlar la expresión génica a través de la contratación de modificadores de la cromatina maquinaria de manera gene-específica y reversible.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

A ADN epigenoma edición representa un potente enfoque terapéutico. Este protocolo describe la producción, purificación y concentración de vectores lentivirales all-in-one que el transgén CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicaciones de edición de epigenoma en células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)-derivado de las neuronas.

Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes

Aquí presentamos un método que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección para generar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sin necesidad de transfección génica o vectores retrovirales. Esta estrategia es, por lo tanto, prometedora para la medicina traslacional y representa un avance notable en la tecnología de organoides de células madre.

Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos

Aquí, presentamos un protocolo para la selección in vitro de represores transcripcionales (ETR) diseñados con una alta eficiencia de silenciamiento estable, estable y a largo plazo y una baja actividad fuera del objetivo en todo el genoma. Este flujo de trabajo permite reducir un repertorio inicial y complejo de ETR candidatos a una lista corta, adecuada para una evaluación posterior en entornos terapéuticamente relevantes.

In vitro Selección de represores transcripcionales diseñados para el silenciamiento epigenético dirigido

Se necesitan nuevas estrategias para modelar fielmente las mutaciones somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para estudiar mejor la biología de las células madre hematopoyéticas y las neoplasias hematológicas. Aquí, se describe un protocolo para modelar mutaciones heterocigotas de ganancia de función en HSPC combinando el uso de CRISPR / Cas9 y la transducción dual de donantes rAAV.

Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

El protocolo describe los métodos para la edición del epigenoma basada en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) en líneas celulares humanas mediante la transfección de ADN plasmídico y la nucleofección de ARNm.

Edición del epigenoma CRISPR en células humanas mediante transfección de ADN plasmídico y administración de nucleofección de ARNm

Se proporciona un protocolo detallado para el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 para lograr un knock-in dirigido altamente eficiente de grandes construcciones multicistrónicas en células T humanas primarias a través de la vía de reparación del ADN de unión de extremos mediada por homología (HMEJ). Las células T diseñadas con este protocolo adaptable a las buenas prácticas de fabricación actuales mantienen una excelente expansión celular, citotoxicidad y producción de citocinas.

Ingeniería no viral de células T humanas primarias mediante la integración dirigida de grandes plantillas de ADN mediada por homología

Aprenda a realizar edición epigenética dirigida en células K562 utilizando un sistema CRISPR/dCas9 episomal con efectores dCas9-DNMT3A y dCas9-HDAC1. Este método permite metilación estable del ADN con precisión y efectos fuera del objetivo reducidos.

Ingeniería epigenética de células K562: estrategia episomal de doble vector para la metilación estable del ADN dirigida utilizando proteínas de fusión dCas9-DNMT3A y -HDAC1 (Video) | JoVE Journal

Ingeniería epigenética de células K562: estrategia episomal de doble vector para la metilación estable del ADN dirigida utilizando proteínas de fusión dCas9-DNMT3A y -HDAC1

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