Name: Generación eficiente y rápida de células asesinas inducidas por CAR-T e citocinas en dispositivos escalables por GMP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprende a expandir células CAR-T y CIK de forma escalable usando dispositivos G-Rex compatibles con GMP. Este protocolo garantiza alta viabilidad y funcionalidad citotóxica para aplicaciones clínicas en inmunoterapia oncológica.

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<li>Cadiñanos-Garai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+temporal+mapping+of+CAR+T+cells+reveals+phenotypic+and+functional+remodeling+during+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing.</a> Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).</li>
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<li>Noldner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lung+cancer+tumor-infiltrating+lymphocyte+%28TIL%29+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing.</a> Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).</li>
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La terapia celular adoptiva (ACT) se ha convertido en un pilar importante de las terapias avanzadas para el tratamiento del cáncer. Este enfoque se basa en la administración de productos celulares expandidos ex vivo para lograr eficaciaantitumoral 1. Hasta la fecha, se han utilizado muchos tipos celulares en ACT, desde enfoques antígeno-específicos (por ejemplo, asesino natural (NK)2, asesino inducido por citocinas (CIK)3,4, asesino natural T (NKT)5 o células Tγδ 6, hasta células altamente específicas y personalizadas, como linfocitos infiltrantes en tumores (TIL)7 y terapias basadas en células diseñadas, por ejemplo, receptor de antígenos quiméricos (CAR)1. 8 y células receptoras de células T (TCR) 9,10.
Las células CAR-T son células T genéticamente modificadas generadas por transducción viral ex vivo para expresar un receptor inmunitario sintético diseñado para reconocer un objetivo molecular específico. La estructura CAR consiste en un anticuerpo de fragmento variable de cadena única (scFv) específico para antígeno combinado con dominios de señalización intracelulares, incluyendo la cadena TCRζ y moléculas coestimuladoras. Al activarse con antígenos, el dominio intracelular entrega señales de activación que promueven la proliferación de células T y la actividadantitumoral 11.
Las células CIK son una población heterogénea de linfocitos T activados que adquieren expresión de CD56 durante la expansión ex vivo a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o sangre del cordón umbilical (UCB)12. Esta expansión implica estimulación con interferón-γ (IFN-γ), anticuerpo monoclonal anti-CD3 e interleucina-2 (IL-2), seguida de un cultivo en IL-2 durante 14 días. Las células CIK se parecen funcionalmente tanto a las células NK como a las T, ejerciendo actividad antitumoral tanto a través de mecanismos independientes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) como de mecanismosdependientes 13,14,15,16. Estas propiedades permiten que las células CIK se utilicen tanto en entornos terapéuticos alogénicos como autólogos con un riesgo mínimo de enfermedad del injerto contra el huésped (GvHD) 17.
En la práctica clínica, tanto las terapias celulares CAR-T como CIK requieren la administración de un gran número de células. Las células CAR-T se infunden entre 50 y 200 millones de dosis por paciente18. De manera similar, las células CIK suelen administrarse en dosis de hasta 10.000 millones de células por infusión, con pacientes que suelen recibir múltiples infusiones según el protocolode tratamiento 19. Los métodos tradicionales de cultivo celular que utilizan matrazas o placas son ineficientes, tardados y requieren un paso frecuente, lo que hace inviable la expansión a gran escala y aumenta el riesgo de contaminación. Los sistemas automatizados o semiautomatizados que utilizan cultivos en bolsas o biorreactores permiten una expansión a gran escala, pero presentan limitaciones, es decir, esfuerzo cortante o la necesidad de ajustes de densidad y perfusión frecuente de medios20,21, y la manipulación de un lote a la vez, lo que conlleva altos costes tanto en contextos académicos como industriales. En esta situación desafiante, una alternativa está representada por el dispositivo de expansión rápida permeable al gas (G-Rex), un método de cultivo estático que incorpora una membrana de silicio en el fondo del pozo, que asegura un intercambio eficiente de osígeno y una mayor altura de los recipientes, permitiendo una capacidad de medios de alto volumen. Así, el sistema apoya el crecimiento celular sin reemplazo de medio ni ajuste dedensidad 22,23. Los sistemas G-Rex-M han demostrado escalabilidad de hasta 5000 mL y son compatibles con sistemas automatizados de cosecha, proporcionando una plataforma de cultivo cerrado y libre de contaminaciones que es fácilmente trasladable del ámbito académico al clínico para el desarrollo de medicamentos de terapia avanzada (ATMP)24.
En el procedimiento descrito, aprovechamos las ventajas y características de los dispositivos G-Rex para optimizar el protocolo de expansión tanto de las células CAR-T como CIK. Demostramos que ambos tipos celulares pueden expandirse y escalarse eficientemente, manteniendo un fenotipo y un perfil funcional consistentes entre diferentes sistemas de cultivo. Una visión esquemática del protocolo de expansión tanto para las celdas CIK como para las CAR-T se muestra en la Figura 1.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Visión general de los protocolos de expansión celular CAR-T y CIK utilizando dispositivos de cultivo G-24 o G-6M. Las células CAR-T y CIK se expanden a partir de PBMCs aislados a partir del Día 0. Para la expansión de las células CAR-T, los PBMC se estimulan en el día 1 con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, modificados genéticamente en el día 2, y posteriormente se cultivan con suplementación con hIL-7 y hIL-15 cada 3-4 días, con la extracción final para ensayos funcionales en el día 9. En el formato G-6M, la suplementación con citocinas se limita al día 2, sin necesidad de alimentación adicional con citocinas durante todo el periodo de cultivo. Para la expansión de las células CIK, los PBMC se estimulan el día 1 con rhIFN-γ y en el día 2 con anticuerpos anti-CD3 y rhIL-2, que luego se administran cada 3-4 días. En G-24, se requiere un cambio de medio simultáneamente con el suplemento de citocinas. Las células CIK se extraen en el día 14 para ensayos funcionales posteriores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Brillante Amortiguador de Manchas</td><td>BD Biociencias</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD28, antihumano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-375</td><td>Clon 15E8</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD3, antihumano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-387</td><td>Clon de OKT3</td></tr><tr><td>CD3 BV510</td><td>BD Biociencias</td><td>740147</td><td>Clon UCHT1</td></tr><tr><td>CD314 APC (NKG2D)</td><td>Bioleyenda</td><td>320808</td><td>Clon 1D11</td></tr><tr><td>CD4 BV650</td><td>BD Biociencias</td><td>563875</td><td>Clon SK3</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biociencias</td><td>563429</td><td>Clon HI100</td></tr><tr><td>CD56 PE</td><td>Bioleyenda</td><td>318306</td><td>Clon HCD56</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Biociencias</td><td>555543</td><td>Clon FREG-56</td></tr><tr><td>CD8 BV450</td><td>BD Biociencias</td><td>562428</td><td>Clon RPA-T8</td></tr><tr><td>Kit de proliferación de células violetas CellTrace</td><td>ThermoFisher científico</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>ThermoFisher científico</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco y prime; s Solución salina tamponada con fosfato (D-PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>Placa E 16</td><td>Agilent</td><td>5469813001</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS), Valor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de Viabilidad Reparable 780 (FVS780)</td><td>BD Biociencias</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>Placa G-Rex de 24 pozos &nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80192M</td><td></td></tr><tr><td>Placa de pozo G-Rex 6M &nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80660M</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tampón HEPES</td><td>Lonza</td><td>ECM0180D</td><td></td></tr><tr><td>Su anticuerpo</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-120-718</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina humana 20%</td><td>CSL Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteína recombinante IL-15 humana</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Proteína recombinante IL-7 humana</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20</td><td>BD Biociencias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Tecnologías STEMCELL</td><td>18060</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Línea celular de cáncer de mama y nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina</td><td>Lonza</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Solución fisiológica (0,9% cloruro de sodio)</td><td>Monico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protamina sulfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3369</td><td></td></tr><tr><td>Raji</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Línea celular de linfoma de Burkitt y nbsp;</td></tr><tr><td>IFN-gamma humano recombinante</td><td>R& Sistemas D</td><td>285-IF-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 recombinante (Proleucina)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rhCD19-His</td><td>Invitrogen</td><td>A42607</td><td></td></tr><tr><td>Instituto Conmemorativo Roswell Park 1640 (RPMI-1640)</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina estable</td><td>Lonza</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>Solución Trippan-Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Análisis de celdas en tiempo real xCELLigence</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio Celular Hematopoyético sin suero X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>02-053Q</td><td></td></tr></tbody></table>

generación eficiente y rápida de células asesinas inducidas por car-t e citocinas en dispositivos escalables por gmp

Efficient and Rapid Generation of CAR-T and Cytokine-Induced Killer Cells in GMP-scalable Devices

El protocolo descrito aquí proporciona un flujo de trabajo eficiente y robusto para la expansión e ingeniería ex vivo de células efectoras a partir de PBMCs aisladas, concretamente las células CAR-T y CIK. Este método requiere una manipulación celular mínima y aprovecha la capacidad de intercambio de gases de los dispositivos G-Rex, proporcionando una disponibilidad de nutrientes y oxigenación superiores en comparación con los sistemas convencionales de cultivoestático 23,24. Una ventaja clave de este protocolo es su escalabilidad inherente desde dispositivos de 24 pozos a pequeña escala (G-24), adecuados para estudios preclínicos, hasta dispositivos 6M más grandes (G-6M), compatibles con necesidades de fabricación traslacional o clínica, sin necesidad de cambios en el protocolo más allá de la escala proporcional.
Utilizando este protocolo, tanto las células CAR-T como CIK se expandieron con éxito en paralelo a partir de PBMCs de donantes sanos en los formatos G-24 y G-6M, tal como se describe en las Secciones 2-4. Al final del periodo de cultivo, ambos tipos celulares mostraron una alta expansión de plegamiento y viabilidad, con proliferación comparable entre los dos formatos de dispositivos (Figura 2, Tabla Suplementaria 1, Tabla Suplementaria 2), lo que pone de manifiesto la reproducibilidad del protocolo a diferentes escalas de cultivo.
Para validar la escalabilidad de los dispositivos de cultivo, se caracterizaron aún más las células efectoras fenotípicamente y funcionalmente. Para las células CAR-T CD19, cuantificamos la expresión de CAR y evaluamos los subconjuntos CD4+ y CD8+, observando una predominancia de células T CD19 CAR+ CD8+ (Figura 3A-B, Tabla suplementaria 1). Para las células CIK, evaluamos la frecuencia de las poblaciones de T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) y CIK (CD3+CD56+) (Figura 3D), así como la expresión del receptor activador NKG2D (Figura 3E, Tabla suplementaria 2). Además, observamos fenotipos y expresión globalmente comparables de marcadores poblacionales específicos entre los formatos de cultivo G-24 y G-6M tanto para células CAR-T como CIK. El estado de diferenciación tanto de los productos celulares CD19 CAR-T como CIK se analizó mediante tinción CD62L y CD45RA (Figura 3C-F, Tabla suplementaria 1, Tabla suplementaria 2), revelando fenotipos similares de memoria y efector entre células cultivadas en formatos G-24 y G-6M. Estos hallazgos demuestran que ampliar el proceso no compromete la integridad fenotípica ni el estado de diferenciación de las poblaciones ampliadas de células efectoras.
Por último, para evaluar la potencia funcional, empleamos ensayos de citotoxicidad específica por objetivo. Tanto las células CAR-T CD19 como las CIK expandidas en cualquiera de los dispositivos mostraron una potente actividad citolítica, confirmando el mantenimiento de las propiedades funcionales a escala (Figura 4). En general, estos resultados respaldan la idoneidad de los productos ampliados para aplicaciones posteriores en modelos preclínicos y, potencialmente, ensayos clínicos.
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Proliferación y viabilidad de las células CAR-T y CIK CD19. Las células CAR-T (n = 5) y las células CIK (n = 6) expandidas a partir de PBMCs en placas G-24 y G-6M se recogieron en el día 9 y día 14 de expansión, respectivamente, para realizar el recuento celular y evaluar el aumento de pliegue (A-C) y el porcentaje (B-D) de células viables. Los histogramas representan la expresión media ± desviación estándar (DS), y los puntos indican donantes individuales (véase la Tabla Suplementaria 1 y la Tabla Suplementaria 2 para valores individuales). Los datos se analizaron mediante la prueba t de dos colas emparejada (A-C) o la prueba de rango de múltiples pares emparejados de Wilcoxon de dos colas (B-D), con corrección de Holm-Sidak para comparaciones múltiples (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: La evaluación del fenotipo de las células CAR-T y CIK CD19 se amplió en dispositivos G-24 y G-6M. La expresión de moléculas CAR en células CAR-T CD19 (n = 5) fue analizada mediante citometría de flujo para evaluar (A) la eficiencia de transducción en los protocolos de expansión G-24 y G-6M, así como la expresión de (B) CD4+/CD8+ y (C) subpoblaciones naïves/memoria en el subconjunto CD3+CAR+. El fenotipo de las células CIK a granel (n = 6) fue analizado mediante citometría de flujo para investigar (D) el porcentaje de CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) y T (CD3+CD56-), así como la expresión de (E) NKG2D y (F) subpoblación ingenua/de memoria en el subconjunto CD3+CD56+ (G-24 n=5, G-6M n=6). Ingenua (CD45RA+CD62L+), Memoria Central (CM, CD45RA-CD62L+), Memoria Efectora (EM, CD45RA-CD62L-) y Memoria Efectora CD45RA-positiva (EMRA, CD45RA+CD62L-). Los histogramas representan la expresión media ± SD, y los puntos indican donantes individuales (véase la Tabla Suplementaria 1 y la Tabla Suplementaria 2 para valores individuales). Los datos se analizaron mediante la prueba t pareada múltiple de dos colas (B-C-D-F) o la prueba de rango emparejada de Wilcoxon de dos colas (A-E), con corrección de Holm-Sidak para comparaciones múltiples (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Evaluación de la citotoxicidad de células CAR-T y CIK CD19. (A) La lisis específica de células CAR-T CD19 (naranjas, n = 5) o células no transducidas (UTD) (gris, n = 5) contra la línea celular Raji para linfoma de Burkitt (como modelo de línea celular en suspensión) se realizó mediante un ensayo de muerte basado en citometría de flujo de 6 horas. Los resultados se muestran como la línea media específica de la lisis ± SD. (B) La citotoxicidad de las células CIK cultivadas en G-24 (azul claro, n = 7) o G-6M (azul oscuro, n=6) contra la línea celular MCF-7 del cáncer de mama (como modelo de línea celular adherente) se monitorizó cada 15 minutos durante 24 horas mediante un analizador celular en tiempo real. Los resultados se muestran como la media específica de la lisis ± SEM. Los datos se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney y corrección de Holm-Sidak para comparaciones múltiples (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
Figura suplementaria 1: Estrategia de gating utilizada para análisis de citometría de flujo. Gráficos representativos que ilustran las estrategias de gating para (A) la caracterización fenotípica de células CAR-T y (B) células CIK, y (C) el ensayo de citotoxicidad basado en colorantes fluorescentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_Figure%201_RE.pdf" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria 1: Crecimiento, viabilidad y fenotipo de cultivos de células CAR-T CD19 de donantes individuales. Se muestran el número total de células, el aumento de pliegues, la viabilidad y la caracterización fenotípica de las células T CD19-CAR extraídas en el día 9 de cultivo en dispositivos G-24 y G-6M para cada donante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_1_RE.xlsx" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria 2: Crecimiento, viabilidad y fenotipo de cultivos celulares CIK de donantes individuales. Se muestran el número total de células, el aumento de pliegues, la viabilidad y la caracterización fenotípica de las células CIK recolectadas en el día 14 de cultivo en dispositivos G-24 y G-6M para cada donante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_2_RE.xlsx" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Generación eficiente y rápida de células asesinas inducidas por CAR-T e citocinas en dispositivos escalables por GMP

Adoptive cell therapies (ACT) have progressed rapidly in recent years, playing a pivotal role in cancer immunotherapy and significantly influencing ...

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Research

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