Localización de la membrana plasmática y receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal mediante imagen cuantitativa en células de mamíferos

Comprender el tráfico de los receptores nicotínicos de acetilcolina hacia las membranas plasmáticas de mamíferos es fundamental para investigar la regulación mediada por chaperonas y evaluar terapias selectivas por objetivo. Una ventaja principal de las sondas sensibles al pH combinadas con microscopía confocal de células vivas es la alta resolución espacial de la localización de subunidades. Para empezar, precalenta los reactivos a 37 grados Celsius.

Descongela completamente la subunidad nAChR DNasa y lleva el reactivo de transfección a temperatura ambiente. Limpia todos los reactivos con etanol al 70% antes de meterlos en el armario de bioseguridad. Para expresar nAChR alfa-7, en un tubo microcentrífuga, se diluye la DNasa plasmídica alfa-7 y NACHO en un medio sérico reducido.

Mezcla suavemente pipeteando después de añadir ADN. Alternativamente, para expresar receptores alfa-4 beta-2, se diluyen 4 microgramos de cada ADN subunitario en un total de 250 microlitros de medio sérico reducido y se mezclan suavemente. Ajustar las proporciones de subunidades para optimizar la expresión de isoformas específicas de receptores.

Para receptores alfa-4 beta-2 con un plásmido adicional, añadir cantidades iguales de ADN de cada plásmido. A continuación, en un nuevo tubo de microcentrífuga, diluye 8 microlitros de reactivo de transfección gota a gota en 250 microlitros de medio sérico reducido. Tras una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente, se combina la DNasa diluida con el reactivo de transfección diluido gota a gota en un tubo.

Mezcla suavemente pipeteando y incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. Mientras se forman complejos, se sustituye el medio en los platos de cultivo por 1 mililitro de EMEM sin suero. Añade 500 microlitros del complejo de reactivos de transfección de ADN gota a gota a cada plato.

Mezclar suavemente balanceando la placa para distribuirla de forma uniforme, especialmente sobre la superficie inferior del cristal. Incuba la placa a 37 grados Celsius durante 24 horas y vuelve a colocar el medio tras 4-6 horas. Quita el medio antiguo por succión.

Enjuaga el plato tres veces con dos mililitros de PBS durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. Luego añade 2 mililitros de buffer de imagen pH 7,4 al plato. Inserta el plato de imagen en el portaobjetos de un microscopio confocal y coloca el soporte en la cámara ambiental precalentada.

Conecta el tubo de la bomba peristáltica al portaplatos de imagen y cierra la cámara ambiental. Ahora, lanza el software de imagen y selecciona láseres para los fluoróforos de interés. Escanea la antena para localizar células y hacer imágenes usando un objetivo de 10-60 x.

Aumenta la ampliación si lo deseas y ajusta la profundidad de enfoque según sea necesario. Selecciona la resolución preferida y captura una sola imagen usando el objetivo deseado. Registra la ubicación en el mapa de la antena parabólica para reubicar las mismas celdas tras el cambio de búfer.

Repite la imagen para varias áreas del parabol usando los mismos ajustes de captura para todas las imágenes. Manteniendo solo la línea de salida conectada a la bomba peristáltica, succiona lentamente el tampón de pH 7,4 de la antena hacia un contenedor de residuos. Luego transfiere la línea de entrada al tampón de temple de pH 5,5.

Enciende la bomba peristáltica para añadir un tampón de pH 5,5 a un caudal de 1,5 mililitros por minuto, asegurando que las celdas permanezcan unidas. Tras 20 minutos, apaga la bomba e incuba las células del buffer durante 20 minutos adicionales para permitir el equilibrio. Tras la incubación, repite la imagen de los lugares guardados.

Para comenzar la cuantificación de la imagen, abre ImageJ y carga la imagen que se va a analizar. La imagen aparecerá como una pila con cada canal capturado mostrado en el mismo fotograma. Navega al canal de fase.

Si la imagen parece demasiado brillante, selecciona Procesar y selecciona Mejorar contraste y luego haz clic en Aceptar. Usa la lupa para acercar una celda. Utiliza la herramienta de selección a mano alzada para trazar el contorno de la celda en el canal de fase. Luego cambia al canal fluorescente que corresponde al fluoróforo de interés.

Establece las mediciones deseadas seleccionando Analizar y haciendo clic en Ajustar medidas. Asegúrate de que se comprueben el Área, el valor gris medio y la densidad integrada. Para medir la región seleccionada, elige Analizar y luego haz clic en Medir.

Realiza tres mediciones de fondo trazando áreas vacías cerca de la celda seleccionada. Después de realizar mediciones para todas las celdas deseadas, copia y pega los datos de medición en Excel para su análisis. Luego calcula la media de fondo a partir de las tres mediciones de fondo.

Calcular el valor corregido de fluorescencia total de células o CTCF para cada célula utilizando la fórmula proporcionada. Usando el mismo flujo de trabajo, analiza las imágenes adquiridas tras el cambio de búfer. Exporta todos los resultados a un software de análisis de datos para el procesamiento estadístico.

Se observó una tinción débil con alfa-BTX AF647 en células N2a no transfectadas, mientras que se detectó marcaje puntuado robusto en células transfectadas con ADN alfa-7. La cuantificación confirmó que la expresión plasmática de nAChR alfa-7 fue significativamente mayor en células N2a transfectadas alfa-7 que en controles no transfectados. A pH 7,4, se observaba fluorescencia total de alfa-7 pHuji en la membrana plasmática.

en células transfectadas de N2a. A pH 5,5, la fluorescencia alfa-7 pHuji se redujo, revelando la localización interna del receptor. La fluorescencia externa del receptor alfa-7 pHuji explicaba la mayor parte de la expresión del receptor.

La cuantificación mostró que el 82,6% de los receptores alfa-7 pHuji estaban localizados en la membrana plasmática, mientras que el 17,4% estaban internos. La fluorescencia se restauró al volver a pH 7,4, confirmando la reversibilidad de la señal pHuji. A pH 7,4, las células N2a que expresaban alfa-4 SEP y beta-2 pHuji mostraron una fluorescencia robusta de membrana para ambas subunedades.

A pH 5,5, se apagó la fluorescencia, lo que indicaba la localización interna de algunas subunidades alfa-4 SEP y beta-2 pHuji. La cuantificación mostró que el 76,5% de la SEP alfa-4 estaba en la membrana plasmática y el 23,4% en la interna. En células transfectadas triplemente, la SEP alfa-4 mostró un 82,8% de localización de membrana y un 17,2% de expresión interna.

En las mismas células, el 63,4% de las subunidades beta-2 pHuji estaban localizadas en la membrana, mientras que el 36,6% estaban localizadas intracelularmente. Utilizando el protocolo presentado, caracterizamos los nuevos efectos de la chaperona sobre la expresión y el tráfico de receptores nicotínicos, y evaluamos nuevas terapias selectivas por objetivos. Una ventaja de nuestro protocolo es la adaptabilidad para receptores nicotínicos homoméricos y heteroméricos, lo que permite cuantificar la ubicación celular relativa.

Nuestro enfoque permite una expresión rápida y robusta de la membrana plasmática de los receptores nicotínicos, facilitando el análisis de tráfico mediado por chaperonas y los esfuerzos de descubrimiento de fármacos.