Name: Localización de la membrana plasmática y receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal mediante imagen cuantitativa en células de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a cuantificar la localización de receptores nicotínicos de acetilcolina en membrana plasmática y compartimentos intracelulares usando células N2a de mamífero con etiquetas fluorescentes sensibles al pH y microscopía confocal.

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<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1X)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Reactivo de desprendimiento celular</td></tr><tr><td>Alfa-Bungarotoxina Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>B35450</td><td>Conjugado de alfa-bungarotoxina</td></tr><tr><td>Gabinete de Bioseguridad de nivel 1 BSL & nbsp;</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Área de trabajo de cultivo celular estéril</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9224</td><td>Componente búfer</td></tr><tr><td>D-(+)-glucosa</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td>Componente búfer</td></tr><tr><td>EMEM con L-glutamina</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Medio celular</td></tr><tr><td>ADN libre de endotoxinas</td><td>Fabricado en casa usando kits Zymo</td><td>No aplicable</td><td>ADN nAChR para uso en transfecciones transitorias celulares</td></tr><tr><td>Tubos microcentrífugas libres de endotoxinas, 0,5 mL&nbsp;</td><td>Aventor/VWR</td><td>89000-010</td><td>ADN y preparación por transfección</td></tr><tr><td>Tubos microcentrífugas libres de endotoxinas, 1,5 mL&nbsp;</td><td>Aventor/VWR</td><td>20170-038</td><td>ADN y preparación por transfección</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Aventor/VWR</td><td>97068-085</td><td>Suplemento sérico</td></tr><tr><td>Fluoview FV10i</td><td>Olimpo</td><td>FV10i</td><td>Microscopio Confocal</td></tr><tr><td>Platos de cristal con fondo MatTek</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>Antenas de imagen</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v. 10</td><td>GraphPad Prism</td><td>https://www.graphpad.com/features</td><td>Software de análisis de datos</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>H3375</td><td>Componente búfer</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidrato</td><td>Termociencia</td><td>413410025</td><td>Componente búfer</td></tr><tr><td>MES hidrato</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>M5287</td><td>Componente búfer</td></tr><tr><td>mTagBFP2-pBAD</td><td>AddGene&nbsp;</td><td>54572</td><td>ADN de control para transfección transitoria celular &nbsp;</td></tr><tr><td>Células Neuro 2 A (N2a)</td><td>Colección de Cultura de Tipo Americano</td><td>CCL-131</td><td>Células utilizadas para transfecciones de ADN y expresión de nAChR</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Medio sérico reducido</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Aventor/VWR</td><td>K952-100mL</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>Bomba de peristalsis</td><td>Gilson</td><td>MiniPuls3</td><td>El buffer cambia al hacer imagens&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Calidad Biológico</td><td>119-069-131</td><td>Amortiguador salino</td></tr><tr><td>Pipete Aid</td><td>Drummond y Drummond;</td><td>140084</td><td>Transferencia precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Puntas de pipete (estériles y libres de endotoxinas, 1000 μL)</td><td>Rainin</td><td>30389216</td><td>Transferencia precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Puntas de pipete (estériles y libres de endotoxinas, 20 μL)</td><td>Rainin</td><td>30389229</td><td>Transferencia precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Puntas de pipete (estériles y libres de endotoxinas, 250 μL)</td><td>Rainin</td><td>30389246</td><td>Transferencia precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pipettes, P10</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>L-10XLS</td><td>Transferencia precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pipettes, P100</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>L-100XLS</td><td>Transferencia precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pipettes, P1000</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>L-1000XLS</td><td>Transferencia precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>P3911</td><td>Componente búfer</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (estériles y libres de endotoxinas, 10 ML)</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-898</td><td>Transferencia precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (estériles y libres de endotoxinas, 25 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-900</td><td>Transferencia precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (estériles y libres de endotoxinas, 5 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>76201-710</td><td>Transferencia precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (estériles y libres de endotoxinas, 50 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>75816-088</td><td>Transferencia precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9286</td><td>Componente búfer</td></tr><tr><td>Matraz de cultivo de tejidos</td><td>Halcón</td><td>353109</td><td>Cultivo de platos</td></tr><tr><td>Kit de plásmidos ZymoPure II Maxiprep</td><td>ZYMO INVESTIGACIÓN</td><td>D4203-A + D4203-B</td><td>Producción de ADN libre de endotoxinas</td></tr><tr><td>&alfa; 4-SEP&nbsp;</td><td>Servicios de síntesis genética de ThermoFisher Scientific GeneArt &nbsp; &nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>Servicios personalizados de síntesis génica</td></tr><tr><td>&alfa; 7-pHuji</td><td>Twist Bioscience</td><td>https://www.twistbioscience.com/</td><td>Servicios personalizados de síntesis génica</td></tr><tr><td>&beta; 2-pHuji</td><td>Servicios de síntesis genética de ThermoFisher Scientific GeneArt &nbsp; &nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>Servicios personalizados de síntesis génica</td></tr></tbody></table>

localización de la membrana plasmática y receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal mediante imagen cuantitativa en células de mamíferos

Localization of Plasma Membrane and Intracellular Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors Using Quantitative Imaging in Mammalian Cells

Localización de la membrana plasmática y receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal mediante imagen cuantitativa en células de mamíferos

Quantification of neuronal nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) expressed on the plasma membrane of mammalian cells is important for the development ...

localization-plasma-membrane-intracellular-neuronal-nicotinic

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Hemos desarrollado una nueva técnica para cuantificar los cambios de los receptores nicotínicos de acetilcolina en las regiones subcelulares de los subtipos específicos de neuronas del sistema nervioso central para comprender mejor los mecanismos de la adicción a la nicotina mediante el uso de una combinación de enfoques que incluyen el etiquetado proteína fluorescente del receptor con el golpe-en el enfoque y espectral imagen confocal.

Imagen confocal espectral de marcado con fluorescencia receptores nicotínicos en Knock-en ratones con administración crónica de nicotina

Mediante el etiquetado de los dominios extracelulares de los receptores de membrana con pHluorin superecliptic, y por imágenes de estos receptores de fusión en las neuronas de ratón en cultivo, se puede visualizar directamente los eventos de inserción individuales vesiculares de los receptores a la membrana plasmática. Esta técnica será fundamental para elucidar los mecanismos moleculares que regulan la inserción del receptor en la membrana plasmática.

Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

Fuente: Zhang, J., et al. Análisis cuantitativo de inmunogold de alta resolución de receptores de membrana en sinapsis de cinta de retina. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra una técnica de microscopía electrónica para visualizar la localización del receptor de neurotransmisores en las sinapsis de la retina. Las secciones de la retina contienen células ganglionares de la retina que exhiben receptores de neurotransmisores unidos a la membrana y están marcadas con la subunidad B de la toxina...

Imágenes de alta resolución de los receptores de neurotransmisores en las sinapsis de la retina

En este artículo, se describe un método útil para estudiar ligandos función del canal iónico en las neuronas de rodajas de cerebro agudamente aisladas. Este método implica el uso de una micropipeta de relleno de fármaco para aplicación local de medicamentos a las neuronas registradas utilizando técnicas estándar de patch clamp.

La aplicación local de medicamentos para estudiar la función del receptor nicotínico de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón

Desarrollamos una preparación génica-quimérica del circuito ventral hipocampo-accumbens in vitro que permite obtener imágenes directas en vivo para analizar los mecanismos presinápticos de la transmisión sináptica mediada por los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs). Esta preparación también proporciona un enfoque informativo para estudiar los mecanismos pre y postsinápticos de la plasticidad sináptica.

Imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento Junto ventrales hipocampo axones

El método de inmunogold postincrustado es una de las formas más efectivas de proporcionar análisis de alta resolución de la localización subcelular de moléculas específicas. En este trabajo describimos un protocolo para analizar cuantitativamente los receptores de glutamato en las sinapsis de la cinta retiniana.

Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

Las técnicas de microscopía óptica junto con ensayos bioquímicos dilucidan la implicación de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones dependiente de la netrina. Esta combinación de técnicas permite identificar los mecanismos moleculares que controlan la ramificación de los axones y el cambio de forma de las células.

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

La utilización de receptores de etiquetado pHluorin de Seguimiento de localización subcelular y el Tráfico

Este artículo presenta un método para el estudio de los receptores acetilcolina nicotínicos (nAChRs) en rebanadas de cerebro de ratón por uncaging de nicotina. Cuando se combina con revisión simultánea abrazadera grabación y láser de 2 fotones microscopía, nicotina uncaging conecta función del receptor nicotínico con morfología celular, proporcionando una comprensión más profunda de la neurobiología colinérgico.

Sondeo de la función de Receptor nicotínico de la acetilcolina en rebanadas de cerebro de ratón mediante fotólisis de destello láser de la nicotina Photoactivatable

Aquí, describimos un enfoque cuantitativo para determinar la distribución de una proteína sináptica en relación con un marcador proteico utilizando tinción de inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis basados en computadoras.

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Aprende a cuantificar la localización de receptores nicotínicos de acetilcolina en membrana plasmática y compartimentos intracelulares usando células N2a de mamífero con etiquetas fluorescentes sensibles al pH y microscopía confocal.

Localización de la membrana plasmática y receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal mediante imagen cuantitativa en células de mamíferos (Video) | JoVE Journal

Localización de la membrana plasmática y receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal mediante imagen cuantitativa en células de mamíferos

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