Generación de un modelo basado en organoides prostáticos de ratón para estudiar las interacciones huésped-patógeno

Esta investigación se centra en comprender cómo los patógenos bacterianos infectan el epitelio prostático y qué interacciones huésped-patógeno determinan el resultado de la infección. Los modelos in vitro existentes capturaron mal la diversidad epitelial prostática. Este modelo proporciona un sistema fisiológicamente relevante que refleja los diferentes tipos celulares presentes en el tejido.

Para empezar, se cultivan organoides prostáticos murinos tridimensionales en gotas de matriz extracelular en una placa de 24 pozos. Aspira el medio del número deseado de pozos y añade 500 microlitros de medio fresco a cada pozo. Con una pipeta P 1000, se interrumpe mecánicamente la caída de la matriz extracelular en cada pozo.

Recoge esta suspensión en un tubo cónico de 15 mililitros con no más de dos pozos recogidos por tubo. Añade un medio de cultivo fresco para llevar el volumen a 10 mililitros. Invierte suavemente el tubo tres o cuatro veces para mezclarlo y centrifugar a 450 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Aspira el sobrenadante. Vuelve a suspender el pellet en dos mililitros de solución enzimática, precalenta a 37 grados Celsius e incuba la suspensión en un baño maria a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Utilizando una pipeta P 1000, mezcla la suspensión celular cada cinco minutos durante la incubación.

Tras la incubación, añade medio de cultivo fresco para alcanzar un volumen final de 10 mililitros. Invierte suavemente el tubo tres o cuatro veces para mezclar. Centrifuga a 450 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Aspira el sobrenadante sin alterar el pellet. Resuspende el pellet en 300 microlitros de medio de cultivo suplementado con 10 inhibidores de roca micromolar. Utilizando una cámara de conteo de neubauer, cuenta las células en la suspensión.

Diluir la suspensión a una concentración de 62.500 células por mililitro en un medio de cultivo suplementado con 10 micmolares inhibidores de roca. Luego siembra 200 microlitros de la suspensión por pozo para una placa de 48 pozos y 300 microlitros por pozo para microportaobjetos con cámara. Incuba las placas en una incubadora de cultivos celulares a 37 grados Celsius y al 5% de dióxido de carbono.

Después de un día, comprueba si la mayoría de las células individuales se han adherido a la superficie bidimensional del cultivo. Sustituye el medio de cultivo cada dos o tres días y continúa cultivando hasta alcanzar la confluencia en siete días. Para inducir la diferenciación que enriquece las células luminales, añadir 10 nanomolares de cinco alfa dihidrotestosterona o DHT a la suspensión celular durante la siembra.

Estirar la cepa uropatogénica de Escherichia coli, o UPEC, sobre una placa de agar LB suplementada con 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Incuba la placa a 37 grados Celsius durante 16 a 24 horas. Utilizando un anillo estéril, inocúla tres mililitros de caldo LB suplementados con 100 microgramos por mililitro de ampicilina con una sola colonia bacteriana.

Incuba el cultivo de forma estática a 37 grados Celsius durante 12 a 16 horas. Haz un vórtice en el cultivo bacteriano durante la noche. Mide la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros.

Luego, calcular el volumen de cultivo necesario para alcanzar una densidad óptica inicial de 0,05 en tres mililitros de caldo. Añadir el volumen calculado de cultivo bacteriano al caldo fresco de LB suplementado con ampicilina. Incuba estáticamente a 37 grados Celsius durante 24 horas.

Tras la incubación, se aplica un vórtice al cultivo bacteriano. Mide la densidad óptica a 600 nanómetros. Calcula el volumen de cultivo necesario para alcanzar una densidad óptica de uno.

Centrifugar el volumen requerido a 12.000 G durante dos minutos a temperatura ambiente. Aspira y desecha el sobrenadante. Resuspende el pellet bacteriano en un mililitro de primus y medio de cultivo organoide libre sin DHT.

Luego, diluye la suspensión con medio de cultivo organoide prostático de ratón para lograr una multiplicidad de infección de 100. Aspira el medio de cultivo del modelo preparado basado en organoides. Añade 200 microlitros de medio de cultivo que contenga bacterias a cada pozo de una placa de 48 pozos.

Incubar durante una hora en una incubadora de cultivos celulares a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono. Aspira las bacterias que contienen el medio de los pozos y lava los pozos tres veces con medio de cultivo fresco para eliminar bacterias extracelulares. A continuación, añade un medio de cultivo que contenga 50 microgramos por mililitro de gentamicina e incuba durante 30 minutos.

Aspira el medio. Añade medio fresco de cultivo, suplementado con 10 microgramos por mililitro de gentamicina durante el tiempo restante de infección. Utiliza un microscopio confocal para obtener imágenes de las células infectadas tras la tinción fluorescente y cuantificar las células infectadas usando un citómetro de flujo.

En la condición de control sin dihidrotestosterona, la mayoría de las células tenían citoqueratina: cinco células basales positivas, con solo unas pocas mostrando baja expresión luminal CD24 8. La suplementación con un nanomolar de DHT produjo poblaciones basales luminales mixtas, aunque el CD 24 A se mantuvo bajo. Aumentar la DHT a 10 nanomolares promovió la diferenciación en células luminales, mientras se mantenían algunas células basales tras siete días de cultivo.

Esto se correlacionó con los estudios de cuantificación que mostraron una disminución de la citoqueratina, cinco células basales positivas y un aumento de células luminales CD24A positivas con un aumento de la concentración de DHT a lo largo del tiempo. A las cero horas de la infección, la UPEC se adhería a las células epiteliales en gran número. Tras una hora de tratamiento con gentamica, el número de células positivas para UPEC disminuyó drásticamente.

A las 24 horas, el número de células infectadas era similar al de una hora. La imagen confocal a las 24 horas mostró que las bacterias intracelulares seguían replicándose formando racimos en forma de comunidad. Este protocolo permite a los investigadores estudiar la dinámica de la infección bacteriana y esas interacciones patógenas en un modelo que preserva la diversidad celular epitelial.

Estudios futuros pueden utilizar este modelo para investigar diversas enfermedades prostáticas, incluyendo infecciones, biología del cáncer y probar posibles compuestos terapéuticos.