Una canalización computacional para la cuantificación de ARN potenciador intergénico / intragénico en células madre embrionarias de ratón

Nuestro grupo investiga la epigenética y epitranscriptómica de potenciadores, centrándose en desarrollar métodos precisos para cuantificar ARN potenciadores como indicadores de activación de potenciadores. Debido a que los potenciadores intragénicos estaban con los transcritos del huésped, distinguir las señales de DER potenciadoras y cuantificarlas con precisión es complicado. Para comenzar, abrir el terminal y escribir el comando para preparar los archivos y referencias necesarios para la identificación del mejorador.

Escribe el comando en el terminal para introducir el directorio de trabajo. Luego ejecuta el comando que copia los scripts de identificación del mejorador al directorio actual. Luego ejecuta el comando correspondiente para generar archivos BED para regiones promotoras, cuerpos génicos y genes codificadores de proteínas usando la anotación de código gen.

Preparar los archivos ATAC-seq y ChIP-seq de histonas para la identificación de potenciadores. Introduce el comando de preprocesamiento correspondiente en el terminal. A continuación, ejecuta el comando para definir y clasificar potenciadores usando datos de pico de cromatina.

Escribe el comando para asignar información temporal de la cadena al archivo BED del potenciador intergénico. A continuación, introduce el comando para determinar la dirección correcta de la cadena para potenciadores intergénicos que se solapan con los genes situados en ambas cadenas. Después, calcula RPKM específico de la cadena para genes que se solapan en potenciadores en la misma hebra.

Luego introduce el comando para finalizar la asignación de hebras para potenciadores intergénicos. Asignar la información final de la cadena a todos los potenciadores intergénicos y sus correspondientes regiones de cima. Escribe el comando en el terminal para moverlo al directorio raíz de la canalización.

Después, utiliza el comando correspondiente para copiar el script de preparación del análisis downstream. Utilizando el comando adecuado, prepara todos los archivos necesarios para la agregación de mejoradores, el procesamiento de señales GRO-seq y la cuantificación de ARN de potenciadores. A continuación, escribe el script para entrar en el directorio de trabajo y luego copia los scripts necesarios para el análisis posterior. Crear gráficos de agregación que muestren patrones de señales de cromatina alrededor de cada tipo de cumbre potenciadora.

Escribe el comando correspondiente en la terminal. Una vez que regresa el prompt, introduce el comando para cuantificar los niveles de expresión de ARN potenciador de GRO-seq usando el número de características. Finalmente, ejecuta el script para visualizar y comparar los niveles de expresión de ARN potenciador entre grupos de potenciadores usando R.In el conjunto de datos GRO-seq.

Las colas de polinucleótidos estaban presentes antes del recorte y se retiraron con éxito tras aplicar los parámetros de recorte; los conjuntos de datos ATAC-seq de fin deteriorados. Las secuencias de adaptadores NextEra se detectaron en ambos pares rojos antes del recorte y se eliminaron tras el preprocesamiento de los conjuntos de datos ChIP-seq para la acetilación H3K27 que mostraron contaminación mínima del adaptador, requiriendo solo el recorte por defecto. El filtrado de los datos de ATAC-seq arrojó 71.165 regiones de cromatina abierta no motoras, que incluyeron 47.317 regiones potenciadoras, de las cuales 23.147 se clasificaron como potenciadoras activas y 24.170 como potenciadoras no activas basándose en solapamiento con marcas de histonas; entre todas las regiones potenciadoras, el 45,2% eran intergénicas y el 54,8% intragénicas. Esta distribución fue similar entre categorías de potenciadores no activos y activos.

Un potenciador intergénico aguas arriba del gen NENO mostró un fuerte enriquecimiento para señales de ATAC-seq, monometilación de H3K4, acetilación de H3K27 y señales de GRO-seq. Un potenciador intragénico cercano al gen CHD2 mostró características de cromatina y transcripción similares al potenciador NENOG, con señales claras en los cuatro conjuntos de datos. Los gráficos de agregación mostraron que los potenciadores activos tenían un enriquecimiento coordinado de señales de ATAC-seq, monometilo H3K4 y acetilación H3K27.

Mientras que los potenciadores no activos carecían de enriquecimiento de acetilación H3K27, pero conservaban señales fuertes de ATAC-seq y H3K4 monometilo. Los potenciadores activos mostraron una transcripción derivada de GRO-seq significativamente mayor que los no activos tanto en regiones intergénicas como intragénicas. Ensamblamos esas canaletas de cálculo de ARNe, conscientes de tendencias, validadas por transcripción dependiente de la actividad en contextos intergénicos o intragénicos.

Abordamos la DER de una cuantificación eARN estandarizada y accesible, especialmente para potenciadores intragénicos confundidos por el genoma del huésped. Revisaremos la identificación autodirigida, separaremos los transcritos operativos tanto de tendencias como de la cadena de análisis de benchmarks a través de ensamblajes genómicos, protocolos experimentales y tipos celulares.