Investigación de un dispositivo LED de luz azul para suprimir patógenos de heridas utilizando un modelo cutáneo sintético basado en colágeno

Nuestra investigación investiga cómo una luz azul de 405 nanómetros puede suprimir de forma segura los patógenos de la herida utilizando un modelo de piel sintética basado en colágeno. La mayoría de los estudios utilizan cultivos de caldo, placas de agar o modelos animales. Presentamos una plataforma realista y reproducible que imita la piel para pruebas de fototerapia.

Para empezar, obtén las cepas bacterianas y fúngicas deseadas. Elige una sola colonia aislada y inocúlala asépticamente en cinco mililitros de caldo de soja tríptico. Una vez que todas las cepas estén inoculadas, incuba los cultivos.

Tras el tiempo de incubación deseado, ajustar la turbidez usando PBS estéril al estándar de McFarland de 0,5 para ensayos antimicrobianos. A continuación, toma secciones de piel sintética hidratada a base de colágeno previamente preparada e inocúla cada sección con 100 microlitros de suspensión microbiana. Usando un separador estéril, distribuye la suspensión de forma uniforme por la superficie.

Luego seca al aire las muestras inoculadas en una cámara estéril bajo condiciones ambientales. Asigna las muestras a tres grupos de tratamiento para diferentes exposiciones a la luz. Para la irradiación, monta el dispositivo LED de luz azul en un disipador de aluminio.

Utiliza un medidor de potencia óptica calibrado para medir la irradiancia en el plano exacto de tratamiento. Ajusta la altura de la sonda para tener en cuenta el grosor del sensor. Ahora ajusta la distancia de lanzamiento del LED para estandarizar la irradiancia de trabajo a 30 milivatios por centímetro cuadrado.

Coloca las muestras de piel inoculadas del grupo B de forma aséptica en placas de Petri estériles sin tapas. Coloca los platos directamente bajo el LED de luz azul e irradia durante 15 minutos para lograr una fluidez objetivo de 27 julios por centímetro cuadrado. De manera similar, irradia el grupo C bajo luz UVC durante dos minutos para lograr una fluencia objetivo de 3,6 julios por centímetro cuadrado.

Tras la irradiación, transfiere la muestra sintética tratada de piel a un tubo estéril de 15 mililitros que contenga nueve mililitros de PBS a pH 7,4 y gíralo suavemente para desalojar microbios adheridos a la superficie. Ahora prepara diluciones en serie de la suspensión multiplicadas por diez. Placar 100 microlitros de las diluciones seleccionadas sobre las placas de agar e incubar las placas.

Al final del periodo de incubación, se cuenta el número de colonias y se registra el número de unidades formadoras de colonias. Calcula la reducción microbiana usando las ecuaciones presentadas. Para simular la exposición nosocomial por el aire, utiliza una cámara de aerosoles acrílico personalizada bajo condiciones ambientales controladas.

Coloca placas de agar estériles dentro de la cámara para monitorizar la actividad de la radiación microbiana. Luego coloca las muestras de piel estériles dentro de la cámara. Utilizando un nebulizador, aerosoliza dos mililitros de suspensión microbiana en la cámara y expone las muestras a luz azul continua a 10 microvatios por centímetro cuadrado desde una distancia de 20 centímetros durante 30 minutos.

Para el control, repite condiciones idénticas de la cámara con el dispositivo de luz azul apagado. Cuantifica los conteos viables a partir de las muestras mediante el análisis estándar de recuento de placas. Para el análisis FTIR, obtén muestras sintéticas de piel e hidrácalas según las instrucciones del fabricante.

Divide las muestras hidratadas en cuatro juegos sobre una superficie estéril. Exponer dos conjuntos de muestras a luz azul de 405 nanómetros con una intensidad de 30 milivatios por centímetro cuadrado. Expone un set durante 15 minutos y el otro durante 60 minutos.

De manera similar, expone dos conjuntos de muestras a luz UVC de 265 nanómetros con una intensidad de tres milivatios por centímetro cuadrado, con un conjunto expuesto durante 15 minutos y el otro durante 60 minutos. Después de la irradiación, seca suavemente las muestras para eliminar la humedad superficial. Analizar las muestras mediante espectroscopía FTIR para evaluar cambios químicos y estructurales.

Configura el instrumento FTIR en modo ATR y prepara la superficie del cristal para la colocación de la muestra. Coloca la muestra sobre el cristal ATR para la adquisición espectral. Realizar comparaciones espectrales directas entre muestras control no tratadas e irradiadas.

A continuación, utiliza la muestra de control sin tratar como referencia de fondo y escanea las muestras irradiadas para obtener espectros restados de referencia. El dispositivo LED de luz azul demostró una eficacia antimicrobiana significativa contra todos los patógenos de heridas probados en modelos de piel sintética. Las reducciones medias de registros muestran diferencias en susceptibilidad dependientes de la especie, con Klebsiella pneumoniae demostrando la mayor sensibilidad a la luz azul y Staphylococcus aureus mostrando una reducción comparativamente menor, aunque aún significativa.

La irradiación UVC logró mayores reducciones microbianas en todas las especies probadas. La irradiación con luz azul y UVC demostró actividad antimicrobiana de amplio espectro contra patógenos bacterianos clínicamente relevantes, incluyendo Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans. La exposición a la luz azul provocó una reducción dependiente del tiempo en los tres patógenos de la herida, con Escherichia coli y Candida albicans inactivándose rápidamente, y Staphylococcus aureus mostrando un declive progresivo más lento.

La eficacia de la luz azul se evaluó aún más bajo condiciones simuladas de contaminación aérea. La exposición continua disminuyó significativamente la deposición microbiana en superficies de piel sintética en comparación con los controles no tratados para cada especie evaluada. Los espectros ATR-FTIR corregidos según la línea base indicaron que el tratamiento con UVC redujo la intensidad de los picos de amida y aumentó las vibraciones de estiramiento carbono-oxígeno, reflejando la descomposición del colágeno.

En cambio, la exposición a la luz azul no indujo cambios espectrales o químicos significativos. Este método evalúa las fuentes de luz de fototerapia mediante pruebas de eficacia antimicrobiana, preservando la integridad y seguridad del colágeno en superficies similares a la piel. El principal desafío de este protocolo es mantener una irradiancia uniforme y un control preciso de la fluidez de las fuentes de luz para asegurar resultados antimicrobianos reproducibles.

Este protocolo puede extenderse a pruebas de biopelícula, análisis de estrés oxidativo, optimización de dispositivos de luz de próxima generación y cribado de intervenciones terapéuticas novedosas similares.