Una técnica sencilla de microaspiración para aislar células somáticas de semen equino criopreservado como donantes nucleares para clonación

Nuestro objetivo es demostrar que las células somáticas del semen equino criopreservado pueden ser útiles para recuperar individuos de alto valor genético. Nuestro desafío actual es poder seleccionar células somáticas con ADN diploide intacto para ser utilizadas como donantes nucleares. Para empezar, retira las pajitas de semen equino del tanque de nitrógeno líquido.

Exponérselos al aire durante 10 segundos y descongelarlos en un baño maria a 37 grados Celsius durante 30 segundos. Toma una muestra de 250 microlitros del semen descongelado. Diluíra con un mililitro de medio DMEM-F12 suplementado.

Incuba la mezcla de semen a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Pipetear 25 microlitros de la dilución incubada en un tubo y diluirlo en 975 microlitros de DPBS suplementado con 0,1 miligramos por mililitro de alcohol polivinílico o polivinil pirrolidona. Mezcla suavemente la suspensión.

Mantén la mezcla de semen diluida a 37 grados Celsius durante todo el proceso de recogida celular. Colocar una tapa de placa de Petri que contenga semen equino diluido en el escenario del microscopio para preparar la recogida de células somáticas. Seleccione una micropipeta de diámetro adecuado para la recogida de células somáticas y conéctala al sistema mecánico de aspiración.

Inserta cuidadosamente la micropipeta en la microgota y alínea la base con la tapa del plato. Una vez que la pipeta aspira el medio de cultivo, comienza la captura individual de células somáticas. Céntrate en la parte inferior de la microcaída, donde se pueden ver varias morfologías celulares.

Coloca la punta de la micropipeta junto a cada célula somática y aspira bajo presión negativa. Recoge todas las células redondas y alargadas, independientemente del tamaño. Después de recoger 10 células, depositalas en una microgota de 10 microlitros situada en la superficie superior de la tapa del plato.

Conserva todas las células somáticas recogidas dentro de esta micro gota durante todo el proceso de recogida. Una vez recogida la cantidad deseada de células somáticas, realiza un procedimiento sencillo de lavado utilizando microgotas para eliminar esperma, residuos y contaminantes microbianos. Utilizando una segunda tapa para platos, realiza un lavado secuencial de tres pasos de las células somáticas.

Utiliza una micropipeta para transferir las células somáticas a la primera gota y déjalas reposar entre tres y cinco minutos. Transfiere las células de la primera gota a la segunda usando el mismo procedimiento. Repite la transferencia una vez más y coloca las células somáticas en la tercera gota.

Finalmente, depositar las células somáticas aisladas en una microgota preparada designada para la transferencia nuclear de células somáticas. La técnica de microaspiración recuperó con éxito células somáticas de semen equino criopreservado, con tasas de captura que oscilaban entre 317,7 y 424,7 células por hora en tres sementales. El semental número 3 muestra el mayor rendimiento.

Se identificaron cinco tipos celulares somáticas distintos basándose en tamaño y morfología. Identificamos una población de células somáticas que difiere en morfología y viabilidad en semen equino criopreservado, lo cual puede ser útil como donante nuclear. Las células pueden seleccionarse en función de su morfología, y el procedimiento no requiere el establecimiento de un cultivo primario.

Nos centraremos en mejorar la viabilidad de estas células tras el volumen del semen equino.