Tinción con peroxisomas en células de mamíferos utilizando sondas específicas de peroxisomas

Por eso, nuestra investigación se centra en comprender los peroxisomas, que son orgánulos esenciales para el metabolismo lipídico y el equilibrio oxidativo celular. Nuestro objetivo es descubrir cómo se regulan su estructura y función y cómo estos procesos cambian en la enfermedad. Para lograrlo, desarrollamos sondas fluorescentes que nos permiten a nosotros y a la comunidad científica en general visualizar peroxisomas en una variedad de células animales.

Aquí desarrollamos protocolos de tinción que funcionan tanto en células vivas como fijas, proporcionando herramientas potentes para estudiar la biología de la paroxetina en salud y patología. Uno de los principales retos experimentales es lograr el marcaje no invasivo de los peroxisomas en células animales. Aunque la tinción por anticuerpos ayuda a superar esto, hay una falta de anticuerpos comerciales para las proteínas paroxísticas.

Otro desafío es visualizar los peroxisomas de forma no invasiva en tiempo real, lo que requiere protocolos adaptables. Y por último, la tinción convencional no proporciona una lectura funcional. Mientras que la tinción basada en peroxidasa puede variar según la función paroxística, lo cual es tanto un desafío como una oportunidad, porque nos permite distinguir estados funcionales paroxísticos dentro de la célula.

Comienza con células de mamíferos sembradas el día anterior en un plato con cubiertas que ahora están en una confluencia del 30 al 70%. Diluir la sonda de peroxisoma con un medio fresco en un tubo microcentrífugo fotosensible para lograr una concentración final de cuatro micromolares. Selecciona el pozo que quieres teñir y etiqueta el exterior con un rotulador.

Aspira 0,5 mililitros de medio del pozo seleccionado y reemplácelos por el medio de sonda preparado, gota a gota, a lo largo de la pared del pozo. Después de dispensar, incubar las células a 37 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. A partir de ese momento, protege las células de la luz usando papel de aluminio.

Después de la incubación, retira cuidadosamente el medio manchado y lava las células dos veces con PBS. Luego, coloca la placa bajo una capucha química, añade un 4% de paraformaldehído en PBS a las células e incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos. Tras la fijación, retira el paraformaldehído en un recipiente de residuos designado y lava las células una vez con PBS.

A continuación, añade 0,5% de Tritón X en PBS para permeabilizar las células e incubarlas durante 2,5 minutos. Tras la incubación, retira el Triton X y lava las células dos veces con PBS durante 10 minutos cada una. Para bloquear las células, incubarlas con albúmina sérica bovina al 5% en PBS durante la noche a cuatro grados Celsius.

Realizar el procedimiento de tinción inmunofluorescente siguiendo el protocolo estándar. Finalmente, realiza microscopía para adquirir imágenes tanto de células fijas como vivas. La tinción de células vivas con sondas Peroxi_SPY resultó en la importación dependiente de la subfamilia D de casetes que se unen a ATP en peroxisomas, produciendo una alta proporción de fluorescencia peroxisoma-citoplasma en células metabólicamente activas.

En células HEK-293T de tipo salvaje que expresan GFP-SKL, la tinción Peroxi_SPY555 mostró una localización clara con peroxisomas, mientras que en las células knockout PEX19 que carecen de peroxisomas, la tinción estuvo ausente. En fibroblastos humanos, Peroxi_SPY tinción colocalizada con el marcador paroxístico GFP-SKL, confirmando la orientación con peroxisomas. La cuantificación de densidad de los peroxisomas reveló una variación significativa entre los diferentes tipos celulares.

Las condiciones de tinción optimizadas en células COS-7 usando 250 nanomolares Peroxi_SPY durante 20 minutos aumentaron significativamente la relación de fluorescencia peroxisoma-citoplasma en comparación con el protocolo original de un micromolar durante 10 minutos. La incubación prolongada de células HEK-293T con Peroxi_SPY durante 24 horas condujo a una mejora en la relación de intensidad de fluorescencia peroxisoma-citoplasma en comparación con 15 minutos, a pesar de la reducción de la tinción con peroxisoma. Un protocolo de fijación permitió el exitoso acostamiento por anticuerpos demostrado mediante la preservación del marcaje Peroxi_SPY y la inmunotinción con Anti-PEX14 en células HuH-7 y HEK-293T.

La cuantificación mostró que los procedimientos de fijación y permeabilización afectaban la intensidad de fluorescencia de peroxisomas en comparación con la tinción de células vivas. Hemos desarrollado el tinte Peroxi_SPY que puede usarse para visualizar peroxisomas tanto en células vivas como fijas en animales. Nuestra sonda fluorescente puede ofrecer un método sencillo y rápido para estudiar la dinámica de los peroxisomas, la heterogeneidad y la disfunción de formas que antes eran limitadas.

Este protocolo permitirá la investigación basada en imágenes con peroxisomas en diversos tipos celulares, incluyendo células derivadas de pacientes con trastornos paroxísticos.