Modelado de la metástasis cerebral: análisis estandarizado de la colonización metastásica y los patrones histológicos de crecimiento mediante inyección intracortical estereotáctica

Nuestro grupo investiga cómo las células tumorales colonizan el cerebro y cómo los patrones de crecimiento metastásico influyen en los resultados clínicos y las respuestas al tratamiento. Para empezar, pesa cada ratón usando una báscula de precisión para calcular el volumen requerido de anestesia en función de su peso corporal. Después de administrar la anestesia, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica precalentada, mantenida a 37 a 38 grados Celsius para apoyar la termorregulación, y luego aplique ungüento para los ojos para proteger la córnea de la sequedad.

Prepara al ratón utilizando una técnica aséptica aprobada por el comité local de ética animal. Desinfecta a fondo el cuero cabelludo usando una solución a base de yodo. Confirma la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie, luego estira la piel hasta que se estira y realiza una incisión en la línea media de aproximadamente tres a cuatro milímetros a lo largo del cráneo usando un bisturí estéril.

Usando el mismo bisturí, raspa suavemente el periosteo para exponer la superficie del cráneo. Asegura la cabeza del ratón en un marco estereotáctico usando barras para los oídos. Usando el brazo estereotáctico, localiza el bregma, luego mueve el brazo dos milímetros hacia adelante y un milímetro lateral hacia la derecha, y marca el sitio objetivo en la corteza frontal con un marcador quirúrgico.

Perfora cuidadosamente el cráneo en el lugar marcado usando un taladro dental de precisión, asegurando que la duramadre no sea penetrada. Confirma la apertura sondeando suavemente el lugar con pinzas estériles. A continuación, resuspende la suspensión de células tumorales pipeteando hacia arriba y hacia abajo para asegurar una distribución uniforme.

Carga tres microlitros de la suspensión en una jeringuilla Hamilton de 10 microlitros y colócala en el chasis estereotáctico usando el soporte correspondiente. Coloca cuidadosamente la aguja de la jeringuilla sobre el orificio de la revancha, asegurándote de que el bisel esté orientado hacia la izquierda para mantener la consistencia de la inyección. Introduce la aguja verticalmente en el tejido cerebral hasta una profundidad de 3,5 milímetros.

Una vez alcanzada la profundidad requerida, retirar lentamente la aguja 0,5 milímetros para ayudar a prevenir el reflujo de la suspensión celular e inyectar lentamente tres microlitros de la suspensión de células tumorales durante un minuto. Después de la inyección, mantenga la aguja en su sitio durante dos minutos adicionales para permitir que las células y la matriz extracelular se asienten y minimizar el reflujo. Luego retira cuidadosamente la jeringuilla y saca el ratón del marco estereotáctico.

Enjuaga suavemente el cráneo con una solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% y sella el orificio de la repisa con cera ósea. Cierra la incisión en el cuero cabelludo usando tres o cuatro suturas que atan cada sutura con tres nudos apretados colocados cerca de los bordes de la herida para una cicatrización óptima. Marca las orejas del ratón usando un patrón de perforador adecuado correspondiente al número de identificación designado.

Luego, reaplica pomada para los ojos si es necesario para evitar el sequeo corneal durante la recuperación y vuelve a colocar el ratón en una almohadilla térmica precalentada mantenida entre 37 y 38 grados Celsius para ayudar a la recuperación tras la anestesia. Limpia y desinfecta a fondo la jeringuilla Hamilton enjuagando la aguja y el barril tres veces consecutivamente, primero con agua destilada, luego con etanol al 70% y finalmente con una solución estéril de cloruro sódico al 0,9%. Después de enjuagar, guarda la jeringuilla Hamilton en hielo hasta su próximo uso.

Finalmente, administrar analgésicos por vía subcutánea mientras el ratón aún está bajo anestesia para asegurar un alivio inmediato del dolor postoperatorio. Los ratones domésticos se recuperan individualmente durante un breve periodo, no superior a una hora, para evitar lesiones por interacciones entre animales despiertos y en recuperación. Si durante el periodo de monitorización se observan signos de malestar o comportamiento anormal, evalúa la función neurológica utilizando la prueba de alambre colgante para valorar la fuerza y coordinación del agarre.

Suspende un ratón en un cable horizontal y registra si llega a una plataforma de escape en 60 segundos. Un ratón sano no logra alcanzar la plataforma y se cae del cable. Tras la eutanasia y la recogida de los tejidos animales, evalúa el patrón histológico de crecimiento de la metástasis y las características asociadas en las láminas digitales de tejido.

Las imágenes macroscópicas confirmaron la ausencia de crecimiento tumoral en ratones de válvula de control inyectados por ECM, mientras que se observaron lesiones metastásicas visibles en ratones inyectados con suspensiones de ECM de células tumorales. Los ratones inyectados con células de cáncer de mama 4T1 o 410,4 mostraron una carga metastásica significativamente mayor en comparación con los controles inyectados por ECM, sin diferencias significativas entre las dos líneas celulares tumorales. El análisis de supervivencia de Kaplan Meyer demostró que los ratones inyectados con 410,4 células tumorales tuvieron una supervivencia global significativamente mayor en comparación con aquellos inyectados con células 4T1.

El análisis histológico mostró que las metástasis cerebrales 4T1 y 410,4 mostraron patrones de crecimiento distintos, con 4T1 mostrando crecimiento epitelial infiltrativo similar a una cadena y 410,4. Una inyección estereotáctica incorrecta provocó crecimiento tumoral en el cráneo y meninges debido a la fuga de suspensión celular, mientras que una inyección intracortical adecuada provocó metástasis parénquimase con posterior diseminación meníngea. Hemos demostrado que los patrones de crecimiento de la metástasis cerebral influyen en el pronóstico y la muerte neurológica, apoyando la relevancia para guiar la toma de decisiones clínicas.

Este protocolo es especialmente útil para estudiar la colonización metastásica en estados tardíos, abordando aspectos clínicamente relevantes como la dinámica del crecimiento y la diseminación secundaria. A diferencia de otros métodos, el modelo estereotáctico asegura la colonización específica del cerebro y preserva la complejidad total del sistema, permitiendo estudios a largo plazo de la progresión tumoral y la respuesta terapéutica. Al proporcionar una plataforma reproducible y clínicamente relevante, nuestro modelo contribuye a comprender los mecanismos de colonización cerebral y a explorar nuevas estrategias terapéuticas.