Determinación de biomasa microbiana en suelo mediante PCR digital de gotas (ddPCR)

Nuestro estudio utiliza PCR digital de gotas y secuenciación del genoma completo para cuantificar con precisión la biomasa microbiana en diversos tipos de suelo. Los métodos convencionales requieren grandes muestras de suelo y productos químicos dañinos. ddPCR utiliza suelo mínimo para la cuantificación absoluta de genes y carbono de biomasa.

Para empezar, monta los reactivos del kit de extracción de ADN del suelo para aislar el ADN de los microbios del suelo a 20 grados Celsius a temperatura ambiente. Gira brevemente el tubo de batido de cuentas de dos mililitros y verifica que las cuentas se hayan asentado en el fondo. Añade 100 miligramos de tierra, luego 800 microlitros de Solución CD1 y haz un vórtice breve para mezclar.

Utiliza un homogeneizador de molino de perlas a una velocidad de seis metros por segundo durante 40 segundos para lisar bien la muestra y centrifuga el tubo de batido de perlas a 15.000 g durante un minuto a temperatura ambiente para lograr la lisis mecánica de la celda. Transfiere el sobrenadante que aún pueda contener partículas de suelo a un tubo de microcentrífuga limpio de dos mililitros. Añade 200 microlitros de Solution CD2.

Vórtice durante cinco segundos y centrifuga a 15.000 g durante un minuto. Transfiere hasta 700 microlitros de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio de dos mililitros sin alterar el perdigón. Añade 600 microlitros de Solución CD3 al sobrenadante y al vórtice durante cinco segundos.

Carga 650 microlitros de la mezcla en una columna de spin y centrifuga a 15.000 g durante un minuto. Descarta el flujo y repite el proceso para el lisado restante. A continuación, coloca la columna de centrifugación en un tubo limpio de recogida de dos mililitros.

Añade 500 microlitros de Solución EA a la columna de spin y centrifuga a 15.000 g durante un minuto a temperatura ambiente. Descarta el flujo y coloca la columna de centrifugación de nuevo en el mismo tubo de recogida. Añadir 500 microlitros de Solución C5 a la columna de centrifugación y centrifugación, como se ha demostrado anteriormente.

Tras descartar el flujo directo, colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de dos mililitros y centrifugar a 16.000 g durante dos minutos a temperatura ambiente. Coloca la columna de spin en un nuevo tubo de elución de 1,5 mililitros. Añade entre 50 y 100 microlitros de la Solución C6 al centro de la membrana filtrante de la columna de espín.

Centrifugar a 15.000 g durante un minuto. Guarda el tubo que contiene el eluente a cuatro grados Celsius después de descartar la columna de espín. Cuantifique el ADN extraído usando un fluorómetro y un kit de análisis de ADN de doble cadena siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para el análisis de bacterias y hongos, selecciona cebadores específicos de 16S rRNA y 18S rRNA. Tras el descongelamiento, vierte todos los reactivos en el vórtice sobre hielo. Configura la Reacción en Cadena Digital de Polimerasa por Gotas, o ddPCR.

Coloca el cartucho generador de gotas, o DG8, en el portacartuchos. Añade un total de 20 microlitros de la mezcla de reacción en cada uno de los pozos de muestra del cartucho. Luego añade 70 microlitros de aceite de generación de gotas para Evagreen en el aceite bien etiquetado del cartucho.

Coloca el cartucho en el generador de gotas y cúbrelo con una junta. Transfiere 40 microlitros de las gotas generadas a cada pozo de una placa semifaldada de 96 pozos para amplificación por PCR. Sella la placa usando un sellador de placas preajustado a 180 grados Celsius durante cinco segundos.

Configura el perfil de ciclo térmico y ajusta la tapa calefactada a 105 grados Celsius. Tras completar la PCR, transfiere la placa de 96 pozos al lector de placas. Usando la versión 2.1 de QuantaSoft, ajusta el umbral de amplitud para separar las gotas negativas y positivas.

De cada pozo, evalúa los parámetros, como el número de copias génicas por nanogramo de ADN, el total de copias génicas por nanogramo de ADN extraído, las copias de genes por gramo de peso seco del suelo procesado en la extracción y el recuento celular por gramo de peso seco de suelo. Además, calcula el carbono de biomasa microbiana, o MBC, correspondiente a bacterias y hongos por gramo de peso seco de suelo por pozo. El análisis triplicado del ADN del suelo en cinco ubicaciones arrojó concentraciones medias de ADN microbiano que oscilaban entre 32 nanogramos y 4.590 nanogramos por gramo de suelo seco por muestra.

El suelo B contenía el menor número de copias del gen 16S rRNA, con una media de 8,8 veces 10, a la potencia de siete y 18 copias del gen de ARNr, a una media de 4,6 veces 10, a la potencia de seis por gramo de suelo seco. En contraste, el suelo E tuvo los mayores recuentos de copias del gen de ARNr 16S y 18S, con una media de 4,4 veces 10 a la potencia de nueve y 2,5 veces 10 a la potencia de nueve respectivamente por gramo de suelo seco, diferiendo significativamente de todas las demás muestras. Aunque las copias fúngicas se mantuvieron similares en los suelos A, B, C y D, los recuentos bacterianos en el suelo D difirieron significativamente tanto de los suelos B como de los E. El contenido microbiano más alto se observó en el suelo E, mientras que el contenido microbiano más bajo se encontró en muestras recogidas en suelo B, que difierían significativamente de los suelos A, D y E. Este protocolo permite a los investigadores medir la dinámica y estructura de las comunidades del suelo mediante biomasa microbiana y proporción fúngico-bacteriana.

El mismo ADN plantilla utilizado para la PCR digital de gotas puede emplearse para la secuenciación de ADN que permita el análisis de comunidades microbianas y funcional.