Imagen de calcio basada en fluorescencia en cultivos epiteliales de las vías respiratorias primarias humanas utilizando segmentación celular automatizada

La transcriptómica unicelular revela heterogeneidad en el epitelio de las vías respiratorias de fibrosis quística. Nuestra intención es entender cómo las funciones y cambios específicos de cada tipo celular afectan a la patogénesis de la enfermedad. El desafío actual es medir con precisión la proteómica y las funciones de células individuales.

Esto aún requiere desarrollo técnico. Para empezar, mantener las células de Calu-3 en matrazas T-25 que contienen medios de cultivo Medios Esenciales Mínimos de Eagle suplementados con 20% FBS y 1% de penicilina estreptomicina. Cuando las células alcancen aproximadamente el 70% de confluencia, lava las células con cinco mililitros de PBS.

Después de lavar, añade un mililitro de TrypLE directamente sobre las células y coloca el matraz en una incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 10 a 15 minutos. Luego neutraliza el TrypLE añadiendo cuatro mililitros de medio de cultivo fresco y completo y mezcla bien la suspensión celular. Placar las celdas en una placa de 96 pozos con una confluencia aproximadamente del 90% al 100%, lo que corresponde a unas 40.000 celdas por pozo.

Permite que las celdas se adhieran a la placa de 96 pozos durante la noche. Cambia el medio cada día y continúa cultivando las células durante dos a cinco días tras la confluencia para permitir la diferenciación. El día del experimento, lava las células de Calu-3 e incubalas con los tintes adecuados.

A continuación, añadir 100 microlitros por pozo de probenecido de 2,5 milimolares diluido en tampón de calcio para mantener el tinte dentro del espacio citoplasmático y envolver la placa en papel de aluminio para protegerla de la luz hasta la obtención de imágenes. Para las células primarias de las vías respiratorias. Retira el medio basolateral del pozo de trans y lava el lado apical añadiendo 300 microlitros de tampón de calcio.

Luego lava el lado basolateral añadiendo 750 microlitros de tampón de calcio. Quita el buffer pipeteando y repite el lavado una vez más en ambos lados. A continuación, incubar las células con 200 microlitros de solución de colorante en el lado apical y 600 microlitros en el lado basolateral durante una hora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Durante la incubación, preparar la thapsigargin diluida en tampón de calcio como un stock intermedio tres veces. Ajusta la concentración a seis micromolares para lograr una concentración final de dos micromolares en el pozo. Tras la incubación, se retira la solución de colorante tanto del compartimento apical como del basolateral pipeteando.

Lava las células dos veces con 300 microlitros de tampón de calcio en el lado apical y 750 microlitros de tampón de calcio en el lado basolateral. Luego retira el buffer pipeteando. A continuación, añade 100 microlitros de probenecídeo 2,5 milimolares en tampón de calcio al compartimento apical, y añade 500 microlitros de la misma solución al compartimento basolateral.

Guardando el inserto transwell dentro de la placa, envuelva toda la placa en papel de aluminio para protegerla de la luz y deja la placa envuelta a un lado para la imagen. Abre la solicitud de Fiyi. Selecciona Archivo y selecciona Abrir para subir el archivo de vídeo.

En la ventana emergente resultante, mantén todos los ajustes predeterminados y confirma la selección. Si lo deseas, ajusta la visualización de la imagen seleccionando Imagen, seleccionando Ajustar y haciendo clic en Contraste de brillo. Modifica el brillo y el contraste de los canales de fluorescencia individuales para lograr una visión óptima de las células.

Para facilitar el trazado de celdas, fusiona canales seleccionando Imagen, eligiendo Color y haciendo clic en Fusionar canales. En la ventana emergente, asigna los archivos correspondientes a cada canal individual y confirma la selección. Para el trazado, selecciona Analizar, Elige herramientas y abre el Administrador de ROI.

En la ventana emergente resultante, activa tanto las opciones de Mostrar Todo como las de Etiquetas. Utilizando la herramienta de selección a mano alzada, traza cuidadosamente las células individuales basándose en los límites celulares y la tinción nuclear. Luego pulsa la tecla T para añadir cada celda trazada a la lista de retorno de la inversión.

Asegúrate de que las células estén trazadas en las cuatro esquinas del campo de visión y en el centro del vídeo. Una vez que todas las celdas hayan sido trazadas con precisión, dentro de la ventana del Gestor de ROI, haga clic en Más y seleccione Multi Measure. En la ventana emergente resultante, pulsa OK para comenzar la medición.

Abre el archivo de vídeo en Fiyi. Optimiza los canales de fluorescencia nuclear y verde para la visualización usando las herramientas de ajuste de imagen. Una vez optimizados los canales, duplica un solo fotograma seleccionando Imagen y Duplicar.

En la ventana emergente resultante, desactive Duplicar pila y guarde la imagen duplicada como archivo de imagen PNG. Repite la duplicación de fotogramas para el otro canal seleccionando Imagen y seleccionando Duplicar. En la ventana emergente, pulsa OK y guarda la imagen como un archivo PNG.

Fusiona las dos imágenes guardadas seleccionando Imagen, eligiendo Color y haciendo clic en Combinar canales. Luego asigna cada archivo PNG al canal correspondiente y confirma la fusión. Sube la imagen fusionada a la celda después de la interfaz gráfica para generar una máscara celular.

Segmentar la imagen usando la tinción nuclear como canal uno y la tinción citoplasmática es el canal dos seleccionando el modelo cyto3. Ahora, guarda la imagen generada de la máscara como un archivo PNG. Ábrelo en Fiji y conviértelo a un archivo TIFF.

Por último, abre tanto el archivo de máscara como el archivo de vídeo original en la suite de calcio arrastrándolos y soltándolos en la interfaz del software. Haz clic en Analizar datos para generar un gráfico descargable y un archivo CSV descargable que contiene valores de intensidad normalizados y en bruto para todas las celdas analizadas. La intensidad de fluorescencia normalizada a la línea base aumentó con el tiempo en células individuales de Calu-3 tras la estimulación de la thapsigargin cuando se midió con Fluo-4 AM y Cal-520 AM; la activación máxima de fluorescencia dependiente de calcio tras la thapsigargin fue significativamente mayor en las células Calu-3 medidas con Cal-520 AM en comparación con Fluo-4 AM. De manera similar, las células primarias individuales de las vías respiratorias y bronquiales mostraron un aumento de la fluorescencia normalizada con el tiempo tras la estimulación de la thapsigargin utilizando cualquiera de los colorantes.

Además, la activación máxima de fluorescencia dependiente del calcio fue significativamente mayor en células cargadas con Cal-520 AM. El análisis basado en aprendizaje automático identificó y cuantificó los cambios de fluorescencia dependientes del calcio en 1.441 células individuales, desde un único campo de visión. Las trazas de fluorescencia normalizadas generadas por el software mostraron respuestas de calcio para las 1.441 células identificadas tras la estimulación de la thapsigargin. Nuestros estudios ayudarán a comprender las respuestas de distintos tipos celulares a su entorno, lo que facilitará el desarrollo de terapias específicas.

Nuestros hallazgos tienen el potencial de centrarse en tipos celulares distintos, para asignar ciertas respuestas de células vivas a estímulos ambientales. En el futuro, tenemos la intención de explorar cómo se altera la señalización específica de tipo celular en enfermedades y células sanas para determinar los tipos responsables.