Name: Imagen de calcio basada en fluorescencia en cultivos epiteliales de las vías respiratorias primarias humanas utilizando segmentación celular automatizada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-22T12:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a realizar imagen de calcio en cultivos epiteliales de vías respiratorias primarias humanas mediante segmentación celular automatizada con aprendizaje automático. Este protocolo permite análisis de señalización calcica a resolución de célula única de forma rápida y sin sesgos.

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<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
<li>Jairaman, A., Prakriya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+airway+epithelial+cells%3A+Current+understanding+and+implications+for+inflammatory+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in airway epithelial cells: Current understanding and implications for inflammatory airway disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (4), 772-783 (2024).</li>
<li>Sammels, E., Parys, J. B., Missiaen, L., De Smedt, H., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+storage+in+health+and+disease%3A+a+dynamic+equilibrium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ storage in health and disease: a dynamic equilibrium.</a> Cell Calcium. 47 (4), 297-314 (2010).</li>
<li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), e1796(2008).</li>
<li>Ren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+protects+RPE+cells+from+necroptosis+and+NLRP3+activation+via+promoting+SERCA2-related+intracellular+Ca2%2B+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Melatonin protects RPE cells from necroptosis and NLRP3 activation via promoting SERCA2-related intracellular Ca2+ homeostasis.</a> Phytomedicine. 135, 156088(2024).</li>
<li>Dwivedi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TMEM16A+blockers+benzbromarone+and+MONNA+cause+intracellular+Ca2%2B+release+in+mouse+bronchial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The TMEM16A blockers benzbromarone and MONNA cause intracellular Ca2+ release in mouse bronchial smooth muscle cells.</a> Eur J Pharmacol. 947, 175677(2023).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, e1067(2009).</li>
<li>Hirst, R. A., Harrison, C., Hirota, K., Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+%5BCa2%2B%5Di+in+whole+cell+suspensions+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of [Ca2+]i in whole cell suspensions using fura-2.</a> Methods Mol Biol. 114, 31-39 (1999).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-disruptive+technique+for+loading+calcium+buffers+and+indicators+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells.</a> Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).</li>
<li>Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Swanson, J. A., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fura-2+secretion+and+sequestration+in+macrophages.+A+blocker+of+organic+anion+transport+reveals+that+these+processes+occur+via+a+membrane+transport+system+for+organic+anions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fura-2 secretion and sequestration in macrophages. A blocker of organic anion transport reveals that these processes occur via a membrane transport system for organic anions.</a> J Immunol. 140 (3), 915-920 (1988).</li>
<li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ca2%2B+indicator+for+long-term+tracking+of+intracellular+calcium+flux%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A novel Ca2+ indicator for long-term tracking of intracellular calcium flux.</a> BioTechniques. 70 (5), 271-277 (2021).</li>
<li>Kageyama, T., Ito, T., Tanaka, S., Nakajima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+immunological+barriers+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Physiological and immunological barriers in the lung.</a> Semin Immunopathol. 45 (4), 533-547 (2024).</li>
<li>Quach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+human+fetal+lung+atlas+reveals+the+temporal+dynamics+of+epithelial+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Early human fetal lung atlas reveals the temporal dynamics of epithelial cell plasticity.</a> Nat Commun. 15 (1), 5898(2024).</li>
<li>Deprez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+human+healthy+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the human healthy airways.</a> Am J Respir Crit Care Med. 202 (12), 1636-1645 (2020).</li>
<li>Prescott, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+in+vitro+air-liquid+interface+culture+models+of+the+human+airway+epithelium+evaluating+cellular+heterogeneity+and+gene+expression+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study of in vitro air-liquid interface culture models of the human airway epithelium evaluating cellular heterogeneity and gene expression at single cell resolution.</a> Respir Res. 24 (1), 213(2023).</li>
<li>Gunawardena, T. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophysiological+and+fluorescence-based+measurements+of+modulator+efficacy+in+nasal+epithelial+cultures+derived+from+people+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophysiological and fluorescence-based measurements of modulator efficacy in nasal epithelial cultures derived from people with cystic fibrosis.</a> Cells. 12 (8), 1174(2023).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+rescue+of+c.3846G%3EA+%28W1282X%29+in+patient-derived+nasal+cultures+achieved+by+inhibition+of+nonsense-mediated+decay+and+protein+modulators+with+complementary+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Functional rescue of c.3846G>A (W1282X) in patient-derived nasal cultures achieved by inhibition of nonsense-mediated decay and protein modulators with complementary mechanisms of action.</a> J Cyst Fibros. 19 (5), 717-727 (2020).</li>
<li>Terrance, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+nasal+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary human nasal epithelial cell culture.</a> Methods Mol Biol. 2725, 213-223 (2024).</li>
<li>Karp, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 115, 115-137 (2002).</li>
<li>Perniss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+succinate%2FSUCNR1-brush+cell+defense+program+in+the+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">A succinate/SUCNR1-brush cell defense program in the tracheal epithelium.</a> Sci Adv. 9 (31), eadg8842(2023).</li>
<li>Sehgal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+sarco%2Fendoplasmic+reticulum+%28ER%29+Ca2%2B-ATPase+by+thapsigargin+analogs+induces+cell+death+via+ER+Ca2%2B+depletion+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the sarco/endoplasmic reticulum (ER) Ca2+-ATPase by thapsigargin analogs induces cell death via ER Ca2+ depletion and the unfolded protein response.</a> J Biol Chem. 292 (48), 19656-19673 (2017).</li>
<li>Cal 520® AM. , AAT Bioquest Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.aatbio.com/products/cal-520-am">https://www.aatbio.com/products/cal-520-am</a> (2025).</li>
<li>Fluo 4® AM. , AAT Bioquest Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552">https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552</a> (2025).</li>
<li>Zaderer, V., Hermann, M., Lass-Flörl, C., Posch, W., Wilflingseder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+the+world+upside-down+in+cellulose+for+improved+culturing+and+imaging+of+respiratory+challenges+within+a+human+3D+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Turning the world upside-down in cellulose for improved culturing and imaging of respiratory challenges within a human 3D model.</a> Cells. 8 (10), 1292(2019).</li>
<li>Becker, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+airway+epithelium+reveals+that+mucociliary+clearance+modulates+SARS-CoV-2+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Live imaging of airway epithelium reveals that mucociliary clearance modulates SARS-CoV-2 spread.</a> Nat Commun. 15 (1), 9480(2024).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Placa de 24 pozos &nbsp;</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>insertos transwell de 24 pozos &nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de poliestireno negro con fondo plano transparente de 96 pozos tratados con TC</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520 AM</td><td>AAT Bioquest&nbsp;</td><td>21130</td><td>Alistado y almacenado a -20&º; C, disuelto en DMSO</td></tr><tr><td>Calcium Suite Software</td><td>El código se puede solicitar contactando con nuestro grupo de laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMEM, 1xs</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>320-005-CL</td><td>Almacenado a 4º grado; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal&nbsp;</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>080-450</td><td>Alistado y almacenado a -20&º; C</td></tr><tr><td>Fluo-4 AM & nbsp;</td><td>AAT Bioquest&nbsp;</td><td>20550</td><td>Alistado y almacenado a -20&º; C, disuelto en DMSO</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP001.5</td><td>Almacenado a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>H3570</td><td>Almacenado a 4º grado; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Línea celular epitelial de adeoncarcinoma colorrectal humano &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-55</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Magnesio y nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>7786-30-3</td><td>Almacenado a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Micro-plato de 35mm, fondo de cristal bajo</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>80137</td><td>Almacenado a temperatura ambiente&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>450-200-EL</td><td>Almacenado a 4º grado; C</td></tr><tr><td>Solución salina con fosfato tamponado (PBS)</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>3111-010-CL</td><td>Almacenado a temperatura ambiente&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio &nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>7447-40-7</td><td>Almacenado a temperatura ambiente&nbsp;</td></tr><tr><td>Probenecid&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>P36400</td><td>Alistado y almacenado a -20&º; C, soluble en agua y nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio y nbsp;</td><td>Bioshop&nbsp;</td><td>SOD004</td><td>Almacenado a temperatura ambiente&nbsp;</td></tr><tr><td>Thapsigargin&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>T7458</td><td>Alistado y almacenado a -20&º; C disuelto en DMSO&nbsp;</td></tr><tr><td>Enzima TripLE Express (1X), fenol rojo y nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>12605010</td><td>Almacenado a 4º grado; C</td></tr></tbody></table>

imagen de calcio basada en fluorescencia en cultivos epiteliales de las vías respiratorias primarias humanas utilizando segmentación celular automatizada

Fluorescence-Based Calcium Imaging in Primary Human Airway Epithelial Cultures Using Automated Cell Segmentation

Imagen de calcio basada en fluorescencia en cultivos epiteliales de las vías respiratorias primarias humanas utilizando segmentación celular automatizada

Calcium signaling is critical in a multitude of biological processes, reinforcing the need to develop methods to study calcium flux in primary tissue. The ...

fluorescence-based-calcium-imaging-primary-human-airway-epithelial

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Biology

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La extensión de la tienda que funciona con...

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Aquí una novela región de interés protocolo de análisis basado en la clasificación de las elipses de mejor ajuste asignados a las regiones de la señal positiva dentro de secuencias de imágenes lapso de tiempo de dos dimensiones se demuestra. Este algoritmo puede permitir a los investigadores a analizar exhaustivamente las señales + Ca 2 fisiológicas con intervención mínima del usuario y el sesgo.

Análisis automatizado de Dinámica Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en secuencias de imágenes

Aquí presentamos técnicas para obtener imágenes de eventos locales de Ca2+ mediados por IP3 utilizando microscopía de fluorescencia en células de mamíferos intactas cargadas con indicadores de Ca2+ junto con un algoritmo que automatiza la identificación y el análisis de estos eventos.

Imagen Ca Local<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en las células de mamífero en cultivo

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

Presentamos un protocolo para realizar mediciones dinámicas del pH líquido de la superficie de las vías respiratorias en condiciones de película delgada utilizando un lector de placas.

En tiempo real, semi-automatizado de medición fluorescente de la superficie de las vías respiratorias pH líquido de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas primarias

Presentamos un protocolo de dos partes que combina imágenes fluorescentes de calcio con hibridación in situ, permitiendo al experimentador correlacionar patrones de actividad de calcio con perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Este protocolo describe la recolección, expansión y diferenciación de células epiteliales nasales a modelos organotípicos de células epiteliales de las vías respiratorias y la cuantificación de la frecuencia de latidos de los cilios a través de imágenes de células vivas y guiones personalizados.

Recopilación, expansión y diferenciación de modelos primarios de células epiteliales nasales humanas para la cuantificación de la frecuencia de latido de los cilios

El protocolo describe un biorreactor habilitado para imágenes que permite la eliminación selectiva del epitelio endógeno de la tráquea de la rata y la distribución homogénea de las células exógenas en la superficie de la luz, seguido de un cultivo in vitro a largo plazo de la construcción célula-tejido.

Biorreactor guiado por imágenes para generar tejido biodiseñado de las vías respiratorias

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en todo el mundo. La calcificación vascular contribuye sustancialmente a la carga de morbilidad y mortalidad cardiovascular. Este protocolo describe un método simple para cuantificar la precipitación de calcio mediada por células del músculo liso vascular in vitro mediante imágenes fluorescentes.

Un método biológico semiautomatizado y reproducible para cuantificar la deposición de calcio in vitro

Hemos desarrollado una técnica de procesamiento tisular que utiliza un vibratomo y tejido pulmonar incluido en agarosa para generar secciones pulmonares, lo que permite la adquisición de imágenes de alta resolución de la arquitectura pulmonar. Empleamos la tinción de inmunofluorescencia para observar la expresión espacial de proteínas utilizando marcadores estructurales pulmonares específicos.

Seccionamiento automatizado de vibratomo de tejido pulmonar incluido en agarosa para obtener imágenes de fluorescencia multiplex

Aquí presentamos un dispositivo novedoso que aplica formas de onda de deformación isotrópicas y uniaxiales a las células, al tiempo que apoya el cultivo en sustratos con rigidez sintonizable y matrices proteicas personalizables. Esta plataforma sencilla y económica permite a los investigadores investigar cómo las señales mecánicas regulan la función celular tanto en estudios fundamentales como en contextos relevantes para enfermedades.

Una plataforma novedosa para el estiramiento e imagen celular in vitro

Aprende a realizar imagen de calcio en cultivos epiteliales de vías respiratorias primarias humanas mediante segmentación celular automatizada con aprendizaje automático. Este protocolo permite análisis de señalización calcica a resolución de célula única de forma rápida y sin sesgos.

Imagen de calcio basada en fluorescencia en cultivos epiteliales de las vías respiratorias primarias humanas utilizando segmentación celular automatizada (Video) | JoVE Journal

Imagen de calcio basada en fluorescencia en cultivos epiteliales de las vías respiratorias primarias humanas utilizando segmentación celular automatizada

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