Montaje reproducible para la imagen in vivo de dos fotones de la contractilidad de los vasos linfáticos cervicales y el flujo linfático en ratones

Presentamos la necesidad de una nueva imagen de la contractilidad de los vasos linfáticos cervicales y la eliminación linfática de glóbulos rojos en ratones. Estudiar las funciones de los vasos linfáticos cervicales es un reto, especialmente cuando se requiere una observación a largo plazo de la contractilidad del flujo linfático y las circulaciones trazadoras. Para empezar, coloca un raíl óptico de acero de 270 milímetros de largo y 43 milímetros de ancho como base del dispositivo.

Instala dos portapostes sobre el raíl óptico de acero, asegurando una distancia de 175 milímetros entre ellos. Inserta dos postes de montaje con un diámetro de 12 milímetros en los portapostes y asegura cada uno usando un tornillo M6. Luego coloca un collar de poste en cada uno de los dos postes de montaje.

Fija una abrazadera de poste fijo en ángulo recto a uno de los postes de montaje y fíjala firmemente usando un tornillo M6. Introduce un poste de montaje de 12 milímetros en el orificio lateral de la abrazadera del poste en ángulo recto. Fija un soporte impreso en 3D al soporte lateral insertado y sujétalo con seguridad usando dos pares de tornillos M3.

Usando pegamento curable por UV, fija un vidrio de cubierta de 12 milímetros de diámetro en la parte inferior de una carcasa protectora impresa en 3D. Luego asegura la carcasa protectora al soporte impreso en 3D usando un par de tornillo/tuerca M4. Instala una mesa pantógrafa de precisión para el movimiento vertical sobre la base del raíl óptico de acero usando dos clips para la mesa y juegos de tornillos, tuercas y arandelas M6.

Luego coloca una caja impresa en 3D de 155 milímetros de largo y 110 milímetros de ancho sobre la mesa. Esta caja sirve como reservorio para la acumulación de solución salina. Cubre el punto de conexión de los cables al elemento calefactor uno con una capa fina de silicona.

Fija el sensor de temperatura uno a la alfombra y sella con silicona. Suelda los cables del elemento calefactor y los sensores de temperatura a un cable de varios hilos. Rellena el punto de conexión con silicona y ciérralo con film retráctil.

Coloca el elemento calefactor dos y el sensor de temperatura dos en el rodillo de espuma. Fija los conectores del cable de alimentación y el botón de encendido a las paredes de la caja de la unidad de control. Instala una fuente de alimentación de corriente continua de 24 voltios, un convertidor reductor de corriente continua y dos módulos MOSFET dentro de la carcasa.

Después de montar el circuito y soldar los componentes necesarios, fija el Arduino Uno y la pantalla del teclado en la carcasa de la tapa. Localiza el campo de selección de temperatura. Ajusta la temperatura y pulsa correr.

Después de anestesiar al ratón, aplica pomada ocular en ambos párpados para evitar que los globos oculares se resequen durante la cirugía. Una vez que cesen los reflejos de retirada de las patas traseras y el reflejo de recoger la cola, coloca al ratón boca arriba sobre el elemento calefactor para dar acceso a la zona abdominal. Conecta la unidad de control a un enchufe eléctrico con una tensión de entrada de 175 a 240 voltios de corriente alterna.

Con cinta médica, fije el cuerpo del animal en una posición paralela a la superficie de la mesa y coloque la cabeza en ángulo respecto al eje sagital de modo que un lado del cuello descanse sobre el rodillo. Envuelve una ligadura alrededor de los incisivos superiores y colócala en la parte trasera del dispositivo, y utiliza cinta médica para ayudar a mantener la temperatura corporal del animal. Después, afeita el pelaje de la zona del cuello.

Luego elimina cualquier pelo suelto que quede y cubre al animal para preservar el campo estéril. Para la desinfección primaria, desinfecta la piel del cuello con un hisopo de alcohol. Luego aplica una solución de clorhexidina al 0,5% o una solución de yodo al 2% para el tratamiento antiséptico y repite el proceso de desinfección dos veces más.

Tras confirmar la profundidad anestésica mediante el reflejo de pellizco en el dedo, realiza una dermatotomía realizando una incisión longitudinal a lo largo de la piel del cuello desde la mandíbula inferior hasta la clavícula, de aproximadamente dos centímetros de longitud. Luego realiza una fasciotomía con tijeras curvas microquirúrgicas. Con pinzas curvas, empuja suavemente hacia un lado las glándulas salivales y los músculos superficiales del cuello para exponer el músculo esternocleidomastoideo.

Asegúrate de que los vasos sanguíneos visibles no se dañen y humedece continuamente el campo quirúrgico con suero fisiofisiológico para evitar daños en el tejido. Utilizar tijeras microquirúrgicas para realizar una miotomía del músculo esternocleidomastoideo, proporcionando acceso a la región entre la tráquea y la arteria carótida. Sigue extendiendo los músculos y la fascia, realizando tanto miotomía como fasciotomía.

A continuación, localiza el ganglio linfático cervical profundo junto con los vasos linfáticos aferentes y eferentes a una profundidad de cinco a siete milímetros. Coloca el dispositivo que sostiene al animal fijo sobre la mesa móvil del microscopio. Y asegura el dispositivo fijándolo firmemente con un tornillo M6 para asegurar la estabilidad durante la imagen.

Coloca el catéter, pre-relleno con solución salina, al poste de montaje usando cinta médica. Coloca un rodillo con un diámetro de un centímetro bajo el elemento calefactor en el lateral de la cabeza del animal para mantener una inclinación de 45 grados respecto a la mesa del microscopio. Luego coloca el catéter fijo en la zona del cuello abierta quirúrgicamente, de modo que quede cerca de la zona de la clavícula del animal, y activa el suministro de suero para llenar la cavidad abierta del cuello con solución fisiológica.

Baja la carcasa protectora sobre la zona del cuello llena de solución salina para que el vaso linfático quede en el centro del campo de observación. Luego coloca la carcasa protectora sobre la tráquea sin ejercer presión. Finalmente, baja la lente de dos fotones no inmersiva en agua dentro de la carcasa protectora a la profundidad correcta según la distancia de trabajo de la lente y realiza la visualización de dos fotones del vaso linfático cervical.

Tras el procedimiento, se confirmó con éxito la identificación de los ganglios linfáticos cervicales profundos mediante la acumulación de Evans Blue en el tejido. Se realizó un seguimiento con dos fotones de la contractilidad del vaso linfático cervical antes y después de la fotobiomodulación. La fotobiomodulación aumentó significativamente la contractilidad del vaso linfático cervical en ratones de 2 y 18 meses con intensidad similar.

El análisis cuantitativo mostró que la contractilidad del vaso linfático cervical fue significativamente menor en ratones de 24 meses en comparación con ratones de 2 y 18 meses. Sin embargo, los valores no diferían significativamente entre ratones de 2 y 18 meses. La fotobiomodulación aumentó significativamente la contractilidad de los vasos linfáticos cervicales en ratones de 2 y 18 meses, pero no tuvo efecto en ratones de 24 meses.

Se observaron glóbulos rojos inyectados en el ventrículo lateral derecho en vasos linfáticos cervicales cuatro horas después de la inyección y continuaron moviéndose a través de la luz a las cinco horas, confirmando el flujo direccional desde el cerebro hacia la periferia. Nuestro protocolo facilita la monitorización in vivo de la función de los vasos linfáticos cervicales, manteniendo la contractilidad hasta cinco horas de observación. Nuestro método ofrece buena reproducibilidad y es compatible con varios microscopios de dos fotones y objetivos objetivos, manteniendo una imagen de alta calidad con profundidades de hasta 500 micrómetros.

Esta técnica puede convertirse en una herramienta universal para estudiar la fisiología del sistema de drenaje cerebral y las funciones de los vasos linfáticos cervicales.