Name: Imagen de superresolución de célula completa mediante DNA-PAINT en un disco confocal giratorio con reasignación óptica de fotones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprende a realizar microscopía de localización de moléculas individuales en células completas mediante DNA-PAINT con microscopio confocal de disco giratorio y reasignación óptica de fotones. Este protocolo simplifica la obtención de imágenes de alta resolución sin necesidad de óptica personalizada.

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<ol><li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+light+sheet+allows+volumetric+super-resolution+imaging+of+efflux+pumps+distribution+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms.</a> Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Ghosh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+interplay+of+CD20+and+therapeutic+antibodies+with+fast+volumetric+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy.</a> Science. 387 (6730), eadq4510(2025).</li>
<li>Wäldchen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Cell+imaging+of+plasma+membrane+receptors+by+3D+lattice+light-sheet+d+STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM.</a> Nat Commun. 11 (1), 887(2020).</li>
<li>Zagato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+devices+for+single+objective+single+plane+illumination+microscopy+%28SoSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+express%22%5BJournal%5D)">Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM).</a> Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. 236, Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Schueder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+super-resolution+imaging+of+whole+cells+using+spinning+disk+confocal+microscopy+and+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT.</a> Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).</li>
<li>Azuma, T., Kei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+spinning-disk+confocal+microscopy+using+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment.</a> Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instant+super-resolution+imaging+in+live+cells+and+embryos+via+analog+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing.</a> Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).</li>
<li>Zaza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+in+whole+cells+and+tissues+via+DNA-PAINT+on+a+spinning+disk+confocal+with+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment.</a> Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+and+super-resolution+microscopy+by+fluorescence+imaging+of+transient+binding+on+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami.</a> Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+accuracy+in+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Localization accuracy in single-molecule microscopy.</a> Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).</li>
<li>Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTetley%2C+R+%22NIS-Elements+JOB+for+DNA-Paint+Acquisition+at+Serial+Z-Planes%22">NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes</a>. , (2025).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).</li>
<li>Schlichthaerle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+single+nuclear+pore+complex+proteins+using+genetically-encoded+probes+for+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT.</a> Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).</li>
<li>Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat-top+TIRF+illumination+boosts+DNA-PAINT+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification.</a> Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
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<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+microtubule+ultrastructure+based+on+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy.</a> Cytoskeleton. , (2025).</li>
<li>Steen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-PAINT+palette%3A+A+comprehensive+performance+analysis+of+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes.</a> Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).</li>
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<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore+dimers+for+DNA-PAINT+and+STED+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy.</a> Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).</li>
<li>Chung, K. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNA-PAINT+for+faster%2C+low-background+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromato-2-ácido carboxílico</td><td>Merck&nbsp;</td><td>238813-5G</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>3,4-ácido dihidroxibenzoico &nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>37580-25G-F</td><td>PCA</td></tr><tr><td>60 y veces; Objetivo Apo NA 1.49</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.0 KDA columna de desalación de espín que contiene resina de exclusión de tamaño &nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>89882</td><td>Columnas de desalación Zeba Spin para el paso 2.4</td></tr><tr><td>Accutasa - Medio de desprendimiento de células enzimáticas</td><td>Célula de Promoción</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP acoplado a ADN personalizado (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')</td><td>Fotónica masiva</td><td>Producto personalizado</td><td>Nanocuerpo anti-GFP para Drosophila</td></tr><tr><td>Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP acoplado con ADN</td><td>Fotónica masiva</td><td>MASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3</td><td>Nanocuerpo anti-GFP para NUP</td></tr><tr><td>Anti-alfa tubulina (YL1/2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-80017</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-conejo</td><td>Fotónica masiva</td><td>Massive-sdAB-FAST 2-Plex, Secundario sdAB F2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR y Zeta; (6B10.2)</td><td>BioLegend</td><td>644102</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Merck&nbsp;</td><td>A4503-10G</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Tubo centrífugo cónico 15 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>17705004</td><td></td></tr><tr><td>Tubo centrífugo cónico 50 mL</td><td>VWR Internacional</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 SoRa</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopio SDC-OPR</td></tr><tr><td>Desalar columnas de espín con Sephadex G-25 (resina de exclusión de tamaño para purificación del ADN) y nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11743309</td><td>Marca: Cytiva. Columnas G-25 para el paso 2.5</td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Medios DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, anhidro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp; (Ditiotreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15976082</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Marck</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Serva</td><td>2311402</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5516-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>MP Biomedicina</td><td>219482580</td><td></td></tr><tr><td>Maleimida-PEG2-succinimidyl&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>746223-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Medios 5A de McCoy</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MES (ácido 2-(N-morfolino)etanolsulfónico)</td><td>Merck</td><td>M3671-50G</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>32213-25L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10418464</td><td></td></tr><tr><td>Tubos microcentrífugas 0,5 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11508232</td><td></td></tr><tr><td>Tubos microcentrífugas 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>10509691&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis de Microvolumen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>Nanodrop</td></tr><tr><td>NaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6546-1L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas 90 nm -Oro</td><td>Citodiagnóstico</td><td>G-90-100</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CMOS Orca Fusion-BT</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>P/S</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (solución 1x)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11530546</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pierce 16% formaldehído (w/v), libre de metanol</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11586711</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio &nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>&nbsp; P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Protocatechuto 3,4-Dioxigenasa &nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P8279-25UN&nbsp;</td><td>PCD</td></tr><tr><td>Sodio&nbsp; Hidróxido</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12963614</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo TOM20</td><td>Abcam</td><td>Ab186735</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de tris</td><td>VWR Internacional</td><td>A4577.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tritón y la palabra Triton; X-100&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR Internacional</td><td>1086031000</td><td></td></tr><tr><td>Preadolescente-20</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtración centrífuga de ultrafiltración, MWCO de 100 kDa</td><td>Merck&nbsp;</td><td>UFC510024</td><td>Fabricante: Amicon Ultra</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 pozos de alto fondo de cristal</td><td>Ibidi</td><td>IB-80807</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-Slide VI 0.5 Fondo de cristal</td><td>Ibidi</td><td>IB-80607</td><td></td></tr></tbody></table>

imagen de superresolución de célula completa mediante dna-paint en un disco confocal giratorio con reasignación óptica de fotones

Whole-cell Super-Resolution Imaging via DNA-PAINT on a Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment

Para demostrar las capacidades de imagen de superresolución del sistema SDC-OPR (Figura 1A), se evaluó su resolución en plano realizando experimentos de imagen DNA-PAINT (Figura 1B) en complejos de poros nucleares (NPCs), que son una estructura de referenciabiológica 17. La Figura 1C muestra una imagen representativa de DNA-PAINT SDC-OPR de la nucleoporina 96 (Nup96), marcada con proteína fluorescente verde mejorada por monoméricos (mEGFPs) y marcada con nanocuerpos anti-GFP conjugados con ADN, en células U2OS. Los paneles ampliados muestran la subestructura NUP, y la Figura 1D muestra proteínas Nup96 emparejadas (indicadas por flechas) consistentes con la simetría esperada de 8 veces de los poros nucleares. En la Figura 1E, la distancia euclidiana entre pares Nup96 se midió alineándolos y graficando el histograma de la sección transversal de la imagen sumada (n = 16 pares). El análisis reveló una separación pico a pico de (13 ± 2) nm (Figura 1E), en concordancia con los resultados de los modelos electromagnéticos así como de las imágenes HILO yTIR 23. Cada ajuste de pico mostraba una desviación estándar de 4 nm, confirmando la alta precisión de localización (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) lograda usando DNA-PAINT en SDC-OPR. Cabe destacar que esta precisión se mantuvo a lo largo de todo el campo de visión de 53 × 53 μm², lo cual es excepcional para sistemas basados en confocales.
Para demostrar la capacidad de la imagen multicolor, Nup96, las mitocondrias y los microtúbulos en células U2OS fueron marcados con ADN para su adquisición usandoExchange-PAINT 18. Esta técnica emplea cadenas ortogonales de ADN conjugadas a un solo fluoróforo, permitiendo excitar todos los objetivos con la misma fuente láser (Figura 2A). En lugar de adquirir señales simultáneamente, las separa a través de rondas secuenciales de imagen, facilitando una integración sencilla en cualquier sistema comercial SDC-OPR. La Figura 2B muestra Nup96 en azul marcado con un nanocuerpo anti-GFP, mitocondrias en rojo con un anticuerpo anti-TOM20 secundario y microtúbulos en verde con un anticuerpo primario anti-α-tubulina. Cabe destacar que la sobresaliente precisión de localización de molécula única obtenida para la imagen Nup96 en un solo color se mantuvo en todos los objetivos del experimento multiblanco, dando valores de precisión de localización de 3,9 nm para el NPC, 4,0 nm para α-tubulina y 3,3 nm para mitocondrias (Figura 2B paneles 1, 2 y 3).
Para la imagen de gran FOV, los microtúbulos en las células HeLa se imaginaron utilizando diversas aumentaciones disponibles en el sistema SDC-OPR, combinadas con diferentes ajustes de binning de la cámara para mantener tamaños de píxeles entre 78 nm y 108 nm (Figura 3). La Figura 3A muestra el citoesqueleto microtubular de 10 células HeLa, con colores que representan la precisión de localización. Con una magnificación del 1×, la precisión media de localización es notablemente inferior en comparación con aumentos mayores (Figura 3B-D), observándose una mayor variabilidad. Esto se debe a la menor densidad de potencia láser sobre el FOV mayor, donde el perfil de iluminación gaussiano se hace evidente, lo que lleva a una menor precisión hacia los bordes del FOV. No obstante, lograr una precisión de localización media de 9,5 nm en el amplio FOV de 211 × 211 μm² es impresionante para sistemas basados en confocales y permite una investigación de alta resolución de la heterogeneidad biológica.
Finalmente, se demuestra la posibilidad de obtener imágenes de células enteras mediante la adquisición de imágenes DNA-PAINT de la red de microtúbulos en células HeLa fijas con un volumen confocal de ~500 nm de espesor y un z-step de 1 μm utilizando la mayor ampliación del sistema (FOV 4×, 53 × 53 μm²). La Figura 4A presenta las imágenes de reconstrucción de molécula única para cada plano z, junto con la precisión de localización correspondiente y los valores de NeNA. Además, se ofrece una visualización en color 3D de la red de microtúbulos en la célula HeLa en la Figura 4C. A medida que aumenta la profundidad, el número de fotones detectados disminuye debido a la dispersión y las aberraciones ópticas, lo que resulta en una menor precisión de localización tanto para las precisiones de localización derivadas del Cramér-Rao Lower Bound (CRLB) (Figura 4A, derecha) como para las calculadas usando la métrica NeNA. Aun así, el alto nivel de recogida de fotones posible por el sistema SDC-OPR permite σSMLM ≤ 10 nm para una profundidad de imagen de hasta 9 μm con distribuciones estrechas. De hecho, las estructuras filamentosas de microtúbulos de doble pared se resolvieron claramente a diversas profundidades: cerca de la interfaz coverslip-celda, en posiciones axiales intermedias y en la parte superior de la celda, con distancia pico a pico entre 30 nm y 40 nm (Figura 4C), consistente con los valoresreportados 24. Estos resultados ponen de manifiesto la capacidad del SDC-OPR para ofrecer imágenes de alta resolución a través de grandes FOV y a lo largo de toda la altura de las células.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Microscopía de localización de molécula única en plano de diferentes muestras celulares e imagen multicolor de superresolución. (A) Esquema del sistema confocal de disco giratorio con reasignación óptica de fotones (SDC-OPR), con una matriz de microlentes diseñada para maximizar la recogida de fotones. (B) Esquema de ADN-PAINT: Las cadenas de ADN marcadas con fluorescencia, conocidas como hebras de imagen, se hibridan transitoriamente con secuencias complementarias de ADN (cadenas de acoplamiento) que están ancladas al anticuerpo/nanocuerpo que apunta a la proteína de interés. Estos eventos de unión de corta duración generan señales de fluorescencia que aparecen como parpadeos estocásticos. (C) Imagen representativa de DNA-PAINT en el sistema SDC-OPR usando aumento de 4× del NPC de las celdas U2OS. La capacidad de alta resolución se demuestra en el reco, donde los NPC individuales están claramente resueltos. (D) ADN-PAINT mejorado por SDC-OPR permite la visualización de NPCs individuales, donde flechas blancas resaltan pares característicos de proteínas Nup96 dentro de la arquitectura del poro. (E) Distribución de mediciones de distancia entre dímeros Nup96 (n=16 pares) dentro de unidades de simetría NPC individuales. Esta cifra ha sido modificada respecto a Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a> 
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Exchange-PAINT para imágenes multicolor usando un microscopio SDC-OPR. (A) Esquema de Exchange-PAINT de tres objetivos fotografiados secuencialmente. Tres dianas proteicas fueron marcadas con anticuerpos funcionalizados por ADN, fragmentos de Fab o nanocuerpos. Las hebras del imerador Cy3B se imaginaron secuencialmente por tipo de hebra, con pasos de lavado entre rondas de imagen. (B) Imagen Exchange-PAINT en tres colores de células U2OS usando microscopía SDC-OPR con aumento de 4×, mostrando microtúbulos (rojo; etiquetados con anti-α-tubulina conjugada con ADN), mitocondrias (verde; nanocuerpos de ADN dirigidos a TOM20), y NPC (azul; Nup96 marcado con mEGFP y nanocuerpos de ADN anti-GFP). Barra de escala: 5 μm. La región ampliada enfatiza la resolución mejorada obtenida en el sistema SDC-OPR, centrándose en (1) mitocondrias, (2) microtúbulos y (3) NUP. Barras de escala = 1 μm. Esta cifra ha sido modificada respecto a Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Imagen de ADN-PAINT dentro de grandes FOV en un microscopio SDC-OPR. Imágenes de ADN-PAINT de microtúbulos (marcaje anti-α-tubulina) adquiridas a múltiples aumentos: (A) aumento de 1× y 1 binning (FOV de 211 × 211 μm²), (B) 2,8× y 2 binning (FOV de 76 × 76 μm²), (C) aumento de 4× y 4 binning (FOV de 53 × 53 μm²). El color representa la precisión de localización de 0 a 16 nm en el caso de una ampliación 1x y de 0 a 4 nm en los demás. (D) Precisión de localización medida a diferentes distancias (en μm) desde el centro del campo de visión para aumentos de 1× (rojo), 2,8× (amarillo) y 4× (verde). Esta cifra ha sido modificada respecto a Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Imagen de ADN de célula entera - PAINT. (A) Izquierda. Imagen volumétrica de microtúbulos en células HeLa mediante DNA-PAINT adquirida mediante SDC-OPR a 4× aumento, mostrando secciones axiales de z = 0 a 9 μm (escalones de 1 μm). Cada plano muestra la posición z , la precisión de localización y la métrica NeNA. Barras de escala: 5 μm (xy). Vale. Precisión de localización frente a profundidad de penetración para todos los planos. (B) Renderizado 3D de la red de microtúbulos en la misma celda HeLa que en (A). El color representa la profundidad de penetración de 0 a 9 μm. (C) Imágenes ampliadas de pequeñas regiones resaltadas de cada profundidad de penetración indicadas en (A). Esta cifra ha sido modificada respecto a Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>

Imagen de superresolución de célula completa mediante DNA-PAINT en un disco confocal giratorio con reasignación óptica de fotones

Single-molecule localization microscopy (SMLM) enables nanoscale imaging of cellular structures but is typically restricted to imaging near the coverslip ...

Nuestro protocolo utiliza DNA-PAINT en un microscopio confocal de disco giratorio con reasignación óptica de fotones para superar limitaciones de profundidad. DNA-PAINT alcanza ahora un nivel extremadamente alto de resolución con multiplexes y capacidades cuantitativas, superando a otras técnicas SMLM como PALM y STORM. Para empezar, utiliza un sistema confocal de disco giratorio equipado con una unidad óptica de reasignación de fotones y una cámara sCMOS.Arranca el sistema 30 minutos antes de la imagen encendiendo el microscopio, la cámara y los láseres. Luego enciende el ordenador. Espera a que el software NIS-Elements cargue completamente.Ahora, selecciona el modo de imagen apropiado en NIS-Elements eligiendo SoRa Spinning Disk antes de establecer los parámetros de adquisición. Elige el objetivo de inmersión en aceite de apertura numérica Apo 60x 1,49 para maximizar la detección de eventos de molécula única. Luego, selecciona la ampliación adecuada según el objetivo, los ajustes de la cámara y la muestra.Ajusta la curvatura de la cámara según se ajuste a la ampliación seleccionada. Establece el tiempo de exposición para la adquisición de ADN-PAINT. Ahora, configura la longitud de onda del láser, la potencia del láser y la rueda de filtros según el espectro de colorantes del imerador.Para registrar la potencia láser tras el objetivo, coloca un sensor calibrado de un medidor de potencia láser en la etapa del microscopio cerca del plano de la muestra y registra la potencia medida. A continuación, aplica una gota de aceite de inmersión sobre el objetivo de aceite limpio de apertura numérica Apo 60x 1.49. Fija la muestra de célula preparada con tinción inmunizada en el escenario del microscopio usando un adaptador para minimizar la deriva.Cambia al modo campo claro y céntrate en el plano de vidrio usando nanopartículas como referencia. Luego activa el Sistema de Enfoque Perfecto para mantener el enfoque durante la adquisición. Con el Sistema Perfect Focus activo, cambiar temporalmente la excitación al canal de proteína fluorescente verde para identificar el plano focal óptimo.Utiliza baja potencia láser durante este paso. Define el nombre del experimento y la ruta de guardado. Marca la casilla de tiempo para establecer el intervalo, la duración y el número de bucles.Establece el intervalo en Sin retardo e introduce el número de bucles correspondiente al número total de fotogramas. Asegúrate de que la casilla PFS en la parte inferior esté seleccionada. Vuelve a los ajustes de excitación SoRa previamente definidos y pulsa Ejecutar ahora.Adquiere entre 15.000 y 20.000 fotogramas para la primera proteína, usando un tiempo de integración de 300 milisegundos. Para el análisis de imágenes, carga la pila de imágenes desconvolutas en el módulo localizado de Picasso. Selecciona Analizar y luego Parámetros en la barra de menú e introduce los parámetros específicos de la cámara según las especificaciones del fabricante.A continuación, ajusta la longitud del lado de la caja a siete para optimizar la precisión de localización de moléculas individuales. Elige un valor mínimo de gradiente neto adecuado y activa la vista previa para visualizar las localizaciones detectadas. Ajusta el umbral de gradiente para minimizar las detecciones de fondo.Ahora, selecciona Analizar y luego Localizar para iniciar la identificación y ajuste de puntos en todas las tramas. Carga el hdf5 resultante en el módulo Picasso Render para visualizar el mapa de localización reconstruido. Elige Postprocess y luego Undrift de RCC.Introduce un valor inicial de segmentación que comienza en 1.000 para obtener un gráfico de deriva xy. Repite con valores de segmentación más bajos para mejorar la corrección de deriva. Haz clic en Archivo y Guardar Localización para guardar el archivo de localización corregido por deriva antes de cerrar el módulo de renderizado.Ahora, carga el archivo corregido por deriva en el módulo de Picasso Filter y aplica umbrales basados en la precisión de localización, los anchos de la función de dispersión puntual, el recuento de fotones y otras métricas de calidad. Haz clic en Archivo y Guardar localización para guardar el archivo de localización filtrado antes de cerrar el módulo de filtro. La imagen por ADN-PAINT de nucleoporina 96 marcada con proteína fluorescente verde mejorada por monoméricos en células U2OS produjo un patrón claro y superresuelto de complejo de poros nucleares en todo el campo de visión.Vistas ampliadas revelaron subunidades emparejadas de nucleoporina 96 dispuestas con la simetría esperada de los poros nucleares de ocho veces. La medición de la distancia euclidiana entre pares alineados de nucleoporina 96 mostró una separación pico a pico de 13 más o menos 2 nanómetros. La nucleoporina 96, las mitocondrias y los microtúbulos se visualizaron simultáneamente en células U2OS con precisión preservada de localización de moléculas individuales en todos los objetivos.Gran campo de visión La imagen de microtúbulos en células HeLa demostró que la precisión de localización variaba con la magnificación y el tamaño del campo, observándose una precisión reducida a aumentos menores. Aumentos más altos producían una precisión de localización mejorada y más uniforme en comparación con la ampliación 1x. La imagen de célula completa se demostró mediante la adquisición por DNA-PAINT de la red de microtúbulos a lo largo de múltiples planos axiales que abarcan toda la profundidad celular.La precisión de localización disminuyó gradualmente con el aumento de la profundidad de imagen. Las estructuras microtubulares de doble pared se resolvieron en múltiples posiciones axiales con distancias pico a pico entre 30 y 40 nanómetros. Nuestro protocolo logra imágenes profundas de ADN-PAINT en células celulares y tejidos sin sacrificar la resolución, utilizando óptica sencilla y comercialmente disponible.El DNA-PAINT de alta resolución funciona principalmente bajo TIRF o alta iluminación, restringiendo la profundidad de imagen a solo unos pocos micrones. Nuestros hallazgos hacen que DNA-PAINT sea accesible para muchos laboratorios, permitiendo la obtención de imágenes a nanoescala en células y tejidos en profundidad.

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Investigación

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Biología

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Imagen de superresolución de célula completa mediante DNA-PAINT en un disco confocal giratorio con reasignación óptica de fotones

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