Name: Desarrollo y estandarización de un micrométodo ex vivo para la cuantificación intracelular de la vincristina en células primarias de ALL por LC-MS/MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprende a desarrollar un método LC-MS/MS para cuantificar la vincristina en células primarias de leucemia linfoblástica aguda pediátrica. Esta técnica mejora el monitoreo terapéutico y la comprensión de la acumulación intracelular del fármaco.

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<ol><li>Inaba, H., Pui, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).</li>
<li>Pui, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+progress+through+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2938-2948 (2015).</li>
<li>Gaudichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+extramedullary+relapse+in+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+reconciling+biological+concepts+and+clinical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues.</a> Blood Rev. 36, 40-56 (2019).</li>
<li>Dhyani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+potential+of+alkaloids%3A+a+key+emphasis+on+colchicine%2C+vinblastine%2C+vincristine%2C+vindesine%2C+vinorelbine+and+vincamine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine.</a> Cancer Cell Int. 22, 206(2022).</li>
<li>Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+intracellular+unbound+drug+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations.</a> Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).</li>
<li>Chien, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+to+determine+intracellular+drug+concentrations+in+cellular+uptake+assays%3A+application+to+metformin+in+organic+cation+transporter+1-transfected+human+embryonic+kidney+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells.</a> Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).</li>
<li>Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+drug+resistance-linked+ABC+transporters+in+cancer+cells+by+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).</li>
<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+a+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).</li>
<li>Borgmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+ALL+blasts+retain+phenotypic+and+genotypic+characteristics+upon+long-term+serial+passage+in+NOD%2FSCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice.</a> Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).</li>
<li>Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+leukemia+relapse+to+induction+chemotherapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> J Vis Exp. (224), e68797(2025).</li>
<li>Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+effect+in+bioanalysis+of+illicit+drugs+with+LC-MS%2FMS%3A+influence+of+ionization+type%2C+sample+preparation%2C+and+biofluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).</li>
<li>Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+sample+preparation+approach+for+mass+spectrometry-based+profiling+of+plasma+results+in+improved+coverage+of+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome.</a> J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+standard+variability%3A+root+cause+investigation%2C+parallelism+for+evaluating+trackability+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations.</a> Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Vial de tapa de rosca de 2,0 mL</td><td>Suministro de caudal</td><td>8-2400</td><td>Usado con insertos de vidrio con muelle (5 x 29 mm) de la misma empresa (Cat. 5-29015)</td></tr><tr><td>Vial de tapa de rosca de 2,0 mL</td><td>Suministro de caudal</td><td>8-2400</td><td>Usado con insertos de vidrio con muelle (5 x 29 mm) de la misma empresa (Cat. 5-29015)</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>100030</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>24010152</td><td></td></tr><tr><td>AIM V</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12055091</td><td></td></tr><tr><td>Sistema cromatográfico Acquity UPLC Clase H</td><td>Waters Co.</td><td>https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW</td><td></td></tr><tr><td>Condesa 3 FL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A49892</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>D 8418</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Botella de cristal</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>41121800</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>PHCBI</td><td>MCO-50M-PE</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>41121702</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>PPB006</td><td></td></tr><tr><td>Speevac miVac</td><td>Fisher Scientific</td><td>56340</td><td></td></tr><tr><td>El software para la adquisición de datos</td><td>Waters Co.</td><td>MassLynx</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas triple cuadrupolo Xevo TQ-S micro</td><td>Waters Co.</td><td>https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador ultrasónico</td><td>Quimis</td><td>Q335D</td><td></td></tr><tr><td>Vinblastina 1 mg/mL</td><td>Libbs</td><td>https://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/</td><td>Vinblastina sulfato</td></tr><tr><td>Vincristine</td><td>Cayman Chemicals</td><td>11764</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo y estandarización de un micrométodo ex vivo para la cuantificación intracelular de la vincristina en células primarias de all por lc-ms/ms

Development and Standardization of an Ex Vivo Micromethod for Intracellular Quantification of Vincristine in Primary ALL Cells by LC-MS/MS

Los resultados cromatográficos representativos obtenidos tras ensayos de acumulación intracelular utilizando células primarias ALL PDX incubadas con VCR y VINB se muestran en la Figura 1. Se prepararon muestras utilizando 2,5 × 106 células por condición. Bajo las condiciones cromatográficas descritas, el VCR se mantuvo consistentemente en 2,85 minutos con un efecto matricial mínimo, y la forma máxima fue simétrica y bien resuelta. Estos perfiles ilustran el comportamiento cromatog...

Desarrollo y estandarización de un micrométodo ex vivo para la cuantificación intracelular de la vincristina en células primarias de ALL por LC-MS/MS

Quantifying intracellular vincristine (VCR) in primary pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) cells is essential for understanding sample-specific ...

Nuestro objetivo es medir la vincristina intracelular en muestras clínicamente relevantes e investigar las interacciones con células farmacológicas. El desafío experimental actual es optimizar el tiempo de incubación entre modelos. Además, la acomodación de medicamentos dependientes del modelo limita la robustez, especialmente en muestras primarias de pacientes.Para empezar, descongela la muestra de células criopreservadas haciendo girar suavemente el frasco en un vaso que contiene 15 mililitros de agua destilada a 37 grados Celsius hasta que el contenido se descongele completamente. Transfiere el contenido del vial a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 15 mililitros de PBS estéril 1X utilizando una pipeta Pasteur desechable y estéril. Coloca el tubo en la centrífuga ajustado a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.Tras la centrifugación, descarta el sobrenadante invirtiendo el tubo en un solo movimiento suave. Ahora, vuelve a suspender el pellet celular en 10 mililitros de medio AIM V usando una pipeta Pasteur desechable. Cuenta las células viables usando un contador automático y mide el tamaño medio de las celdas.Calcular el volumen necesario para obtener 2,5 por 10 a la potencia de seis celdas viables usando una proporción simple basada en la concentración de celda medida. Haz un vórtice en la solución de caldo de vincristina bien antes de usarla. Añadir AIM V Medium a un microtubo de dos mililitros, seguido de 2,5 por 10 a la potencia de seis celdas, y después añadir el volumen necesario de solución de vincristina.Haz un vórtice breve y gira el tubo durante cinco segundos para recoger líquido del tapón. A continuación, incuba los microtubos abiertos a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante tres horas. Tras la incubación, cierra las tapas de los tubos y centrifuga las muestras a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.Descarta cuidadosamente el sobrenadante usando una pipeta. Luego añade un mililitro de PBS a temperatura ambiente al tubo. Tras repetir los pasos de centrifugación y lavado, retira cuidadosamente todo el sobrenadante restante usando una pipeta.resuspende el pellet en 100 microlitros de PBS y vórtice hasta que el pellet esté completamente resuspendido. Ahora, añade 400 microlitros de metanol frío que contiene 0,1 micromolares vinblastina a menos 20 grados Celsius directamente a la muestra, evitando el contacto con las paredes del tubo. Guarda las muestras a menos 80 grados Celsius durante la noche.Preenfría la centrífuga hasta cuatro grados Celsius antes de sacar las muestras del congelador a menos 80 grados Celsius. Inmediatamente después de sacar las muestras del congelador, centrifugarlas a 13.000 G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, transfiere 300 microlitros del sobrenadante a un microtubo de 1,5 mililitros usando una pipeta.Seque completamente las muestras colocándolas en un concentrador al vacío ajustado a 45 grados Celsius durante una hora y 40 minutos. Tras secarse, vuelve a suspender cada pellet en 400 microlitros de agua que contenga un 0,1% de ácido fórmico usando una pipeta. Agita el vórtice suavemente hasta que el pellet esté completamente disuelto.Ahora, centrifuga las muestras de nuevo a 13.000G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Transfiere 300 microlitros del sobrenadante a un vial de dos mililitros con tapa roscada para el análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem. En la pantalla principal del software, abre la lista de muestras y crea una nueva lista introduciendo los nombres de las muestras, volúmenes de inyección, posiciones de los viales y el método a utilizar.Coloca un vial que contenga agua ultrapura en la bandeja del automuestreador y designa este frasco como un espacio en blanco en la lista de muestras. Analiza el formulario entre cada serie de inyecciones triplicadas para evitar transferencias. Selecciona las filas deseadas en la lista de ejemplo y comienza la adquisición de datos haciendo clic en ejecutar y confirmando con OK. Una vez finalizada la ejecución, selecciona una muestra de los resultados y ve los cromatogramas haciendo clic en cromatograma en la barra superior del menú.Por último, en la pantalla de inicio, haz clic en enlaces objetivo. Selecciona los archivos que acaban de ejecutarse y haz clic en procesar. Selecciona el método vincristine y haz clic en OK para generar tablas de salida.El análisis cromatográfico de células xenoinjertas derivadas de leucemia linfoblástica aguda primaria incubadas con un micromolar vincristina durante tres horas mostró consistentemente un pico simétrico y bien resuelto de VCR a los 2,85 minutos, confirmando una retención adecuada y una mínima interferencia matricial. Las curvas de calibración para la vincristina generada en medios AIM V mostraron una fuerte linealidad a través de concentraciones desde 0,001 hasta 10 micromolares. De manera similar, cuando dos veces 10 elevado a la potencia de seis RS4; Se añadieron 11 células, observándose una respuesta lineal desde 0,01 hasta un micromolar.El análisis del curso temporal de la acumulación de vincristina reveló que RS4; 11 células mostraron una meseta en la proporción vincristina por vinblastina entre dos y tres horas, con un aumento modesto entre cuatro y cinco horas, mientras que las células primarias de PDX alcanzaron su máximo a las dos horas y disminuyeron después, apoyando la selección de tres horas como un tiempo de incubación equilibrado. La acumulación normalizada de vincristina varió en seis muestras de pacientes con PDX y se observó una correlación positiva entre las proporciones no normalizadas de vincristina por vinblastina y el volumen celular medio. El análisis de fragmentación confirmó que el pico base de la vincristina correspondía al ion precursor en la relación maestra de carga 413,38, que generó un ion de cuantificación en 392,47 y un ion de confirmación en 383,38 bajo 40 voltios de energía conal y 16 voltios de energía de colisión.Nuestro protocolo supera las limitaciones de los enfoques indirectos al permitir la medición intracelular directa y sensible de fármacos principalmente en células leucémicas. Nuestro enfoque facilita la medición directa de la vincristina intracelular, incluso si el número de votos celulares es bajo. En el futuro, investigaremos si las diferencias en la acumulación intracelular de fármacos están asociadas con la resistencia in vitro y exploraremos mecanismos relacionados.

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Investigación

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Investigación del cáncer

Se describe un método para el seguimiento de la ruptura del endomembrane provocada por las bacterias...

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Competencia metabólica de los sistemas in vitro es un requisito clave para la biotransformación y la disposición de fármacos y sustancias tóxicas. En este protocolo, se describe la aplicación de sondas metabólicos de referencia para evaluar la fase I metabolismo en cultivos celulares.

La espectrometría de masa y enfoques basados ​​en luminogénico para caracterizar la fase I metabólico de Competencia<em&gt; In Vitro</em&gt; Cultivos Celulares

En este sentido, se utilizó la citometría de flujo de imágenes multiespectrales con una característica analítica que compara imágenes detalladas de 3 marcadores de autofagia y cuantifica su co-localización, junto con el recuento de puntos LC3, para medir la autofagia de una manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.

Evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales

Una plataforma de manipulación de células integrada se desarrolla para su uso en conjunto con una configuración de espectrometría de masas de una sola sonda para el análisis en línea de células de suspensión individuales en condiciones ambientales.

Plataforma de manipulación celular integrada junto con la sonda única para el análisis de espectrometría de masas de fármacos y metabolitos en células de suspensión única

Aquí, presentamos un protocolo para etiquetar las vesículas extracelulares derivadas del lisado plaquetario para monitorear su migración y absorción en los explantes de cartílago utilizados como modelo para la osteoartritis.

Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago

Este manuscrito describe cómo evaluar la inmunogenicidad in vivo de las vesículas extracelulares (EV) derivadas de células tumorales utilizando citometría de flujo. Los EV derivados de tumores sometidos a muerte celular inmunogénica inducida por el tratamiento parecen particularmente relevantes en la inmunovigilancia tumoral. Este protocolo ejemplifica la evaluación de los EV tumorales inmunoestimulantes inducidos por oxaliplatino, pero se puede adaptar a diversos entornos.

In vivo Detección de inmunogenicidad de vesículas extracelulares derivadas de tumores mediante citometría de flujo de células T esplénicas

Las vesículas extracelulares (EV) contribuyen a la biología celular y las comunicaciones intercelulares. Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de EV por las células. El protocolo actual propone el ensayo de captación de EV mediante la utilización de imágenes de fluorescencia tridimensional a través de microscopía confocal, después del aislamiento de EV por un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración.

Ensayo de captación de vesículas extracelulares mediante análisis de imágenes con microscopio confocal

Aquí, presentamos un protocolo para medir de manera precisa y confiable los metabolitos en tipos de células raras. Las mejoras técnicas, incluido un fluido de vaina modificado para la clasificación de células y la generación de muestras en blanco relevantes, permiten una cuantificación completa de metabolitos con una entrada de solo 5000 células por muestra.

Metabolómica dirigida en células primarias raras

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Este protocolo se muestra cómo generar tumores clonales fluorescente marcada, genéticamente definidos en el ojo de Drosophila / discos imaginales de las antenas (EAD). En él se describe cómo diseccionar el EAD y el cerebro de la tercera fase larvaria y la forma de procesarlos para visualizar y cuantificar cambios de expresión génica y la invasividad tumoral.

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Aprende a desarrollar un método LC-MS/MS para cuantificar la vincristina en células primarias de leucemia linfoblástica aguda pediátrica. Esta técnica mejora el monitoreo terapéutico y la comprensión de la acumulación intracelular del fármaco.

Desarrollo y estandarización de un micrométodo ex vivo para la cuantificación intracelular de la vincristina en células primarias de ALL por LC-MS/MS (Video) | JoVE Journal

Desarrollo y estandarización de un micrométodo ex vivo para la cuantificación intracelular de la vincristina en células primarias de ALL por LC-MS/MS

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