Trasplante intramuscular de células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas en ratones
10 de abril de 2026
Proporcionamos un protocolo mínimamente invasivo para el trasplante intramuscular de islotes de células madre pancreáticas derivadas de células madre humanas en ratones inmunodeficientes, para implantación in vivo y análisis posteriores.
Estudiamos el desarrollo del páncreas endocrino humano utilizando ojales derivados de células madre para comprender la base genética de la diabetes. El trasplante tradicional de cápsulas renales es altamente invasivo. El protocolo de trasplante intramuscular ofrece una alternativa más sencilla, reproducible y mínimamente invasiva.
Para empezar, añade 0,5 mililitros de solución antiadherente al 5% para cubrir el fondo de una placa de micropozos de 24 pozos que contiene micropozos piramidales invertidos. Centrifuga la placa a 1.300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego examina los micropozos al microscopio en busca de burbujas de aire.
Tras volver a centrifugar la placa, para eliminar cualquier aire atrapado, aspira la solución antiadherente. Luego lava cada pozo con 0,5 mililitros de PBS y repite el paso de lavado una vez más. A continuación, lava los progenitores pancreáticos cultivados desarrollados a partir de hPSC con un mililitro de PBS con 0,5 milimolares de EDTA.
Aspira el PBS con 0,5 milimolares de EDTA y cubre los pozos con tripsina. Luego incuba a 37 grados Celsius durante ocho a doce minutos. Diluir la tripsina con dos volúmenes de DMEM/F12 o PBS y resuspender suavemente las células pipeteando.
Transfiere la suspensión a un tubo cónico y pasa inmediatamente al siguiente paso. Centrifuga la suspensión a 200 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Aspira cuidadosamente el sobrenadante y vuelve a suspender suavemente el pellet en un medio S4 precalentado.
Después, aspira el PBS de las antenas de micropozos. Añade suavemente 1,25 mililitros de las celdas suspendidas a cada pozo de la placa del micropozo. Centrifuga la placa a 100 g durante tres minutos a temperatura ambiente para distribuir las celdas de forma uniforme en los micropozos.
Transfiere cuidadosamente la placa del micropozo a una incubadora humidificada. Para realizar cambios en el medio con medios de diferenciación, aspira suavemente y dispensa el medio a lo largo de las paredes del pozo para evitar turbulencias y desplazar los grupos celulares de los micropozos. Tras transferir la cantidad adecuada de racimos generados a un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros, conecta la jeringuilla al conjunto de tubos de aguja y llénalo con medio S7.
Aspira los racimos directamente desde el tubo de la microcentrífuga. Dobla el tubo por la mitad e inserta la sección doblada en una punta de pipeta de 200 microlitros. Luego inserta el conjunto de agujas de la punta del tubo en un tubo cónico de 15 mililitros y asegura los extremos al borde del tubo usando cinta adhesiva.
Centrifuga el tubo a 100 g durante dos minutos a 4 grados Celsius para compactar los racimos y coloca inmediatamente el tubo sobre hielo. Para trasplantar los racimos a los ratones gamma NOD scid anestesiados, afeitarse la parte medial de la pierna derecha por debajo de la rodilla y desinfectar con etanol al 70%. Luego desconecta el tubo de la punta de la pipeta y conéctalo a la jeringuilla.
Corta el tubo cerca de los racimos compactos y fíjalo al extremo romo de la aguja. Empuja la solución salina hasta que el primer racimo llegue a la punta de la aguja. Luego coloca al ratón boca abajo, inclinándote hacia el lado derecho y extiende la pierna derecha.
Introduce la aguja de cuatro a cinco milímetros de profundidad en el compartimento medial del muslo derecho, entre los músculos aductor y grácil. Luego inyecta los racimos mientras retraes la aguja aproximadamente tres milímetros. Gira la jeringuilla, retira la aguja y deja que el ratón se recupere.
Tras la recuperación del injerto seis semanas después del trasplante y la sección de tejido, realizar inmunotinción para permitir análisis de imagen posteriores. Las suspensiones de célula única de progenitores pancreáticos de la etapa cuatro se colocaron en placas de micropozo para generar agregados tridimensionales controlados por tamaño. En un plazo de 24 a 48 horas, se formaron cúmulos esféricos compactos.
La microscopía de fluorescencia confirmó la presencia de células PDX1 y expresoras de insulina en las líneas reporteras de hPSC. Tras seis semanas, el sitio del injerto se visualizó macroscópicamente con masas similares a ojos identificables dentro del músculo. Tras la excisión, los explantes fueron identificables bajo un microscopio estereoscópico como estructuras pálidas de ataduras esféricas.
Se observó una detección robusta de células positivas para el péptido C en animales trasplantados. La tinción con insulina confirmó la presencia de células humanas similares a la beta dentro del injerto. Se detectaron células positivas para glucagon y somatostatina, lo que indica la preservación de poblaciones celulares alfa y delta.
Este protocolo facilita ensayos funcionales in vivo y la evaluación de la supervivencia y maduración de los injertos humanos trasplantados. La consideración más importante es asegurar una diferenciación de células madre de alta calidad y un manejo suave de células durante la formación de racimos para maximizar la viabilidad y garantizar una buena supervivencia celular. Estos modelos facilitan la investigación de los mecanismos genéticos subyacentes a la diabetes monogénica y a la disfunción de las células beta.
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Descripción general
Este artículo de JoVE presenta un protocolo detallado para el trasplante intramuscular de islotes SC pancreáticos derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en ratones inmunodeficientes. El método ofrece una alternativa menos invasiva al trasplante en la cápsula renal o subcutáneo, permitiendo un acceso quirúrgico sencillo y una recuperación confiable del injerto. El protocolo permite evaluar la función de los islotes mediante la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) in vivo tras una sobrecarga oral de glucosa y facilita el análisis histológico posterior.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Medicina regenerativa
- Terapia con células madre
- Investigación sobre diabetes
Antecedentes
- Las células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas tienen potencial para la terapia celular de la diabetes y la modelización de enfermedades.
- Los sitios de trasplante actuales, como la cápsula renal o el espacio subcutáneo, presentan limitaciones técnicas o fisiológicas.
- A menudo se requiere la implantación in vivo para estudiar la maduración y función de los islotes derivados de células madre en un contexto fisiológico.
- Existe la necesidad de sitios de trasplante reproducibles y accesibles que permitan la recuperación del injerto y la evaluación funcional.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para el trasplante intramuscular de islotes derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en ratones inmunodeficientes.
- Permitir la evaluación del injerto, supervivencia y función de los islotes en un sitio mínimamente invasivo.
- Apoyar la evaluación funcional mediante la prueba de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) in vivo y análisis histológico tras el trasplante.
- Establecer un marco reproducible para la investigación preclínica de la diabetes utilizando islotes derivados de células madre.
Métodos Utilizados
- Preparación y compactación de agregados de islotes SC derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC).
- Cirugía de trasplante intramuscular en ratones inmunodeficientes.
- Evaluación de la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) in vivo tras una sobrecarga oral de glucosa.
- Recuperación del injerto y análisis histológico para la evaluación post-trasplante.
Resultados principales
- Engraftamiento exitoso y supervivencia de islotes derivados de células madre pluripotentes humanas en el sitio de trasplante intramuscular.
- Detección de secreción funcional de insulina en respuesta a un desafío con glucosa mediante la prueba de secreción de insulina estimulada por glucosa in vivo (GSIS).
- Recuperación confiable de los injertos para análisis histológico que confirme la estructura de los islotes y la expresión de marcadores.
- Demuestra un método reproducible y mínimamente invasivo para estudios preclínicos de trasplante de islotes.
Conclusiones
- El trasplante intramuscular es un sitio viable y accesible para el injerto de islotes derivados de células madre pluripotentes humanas en ratones.
- El procedimiento permite la evaluación funcional de islotes derivados de células madre mediante la prueba de secreción in vivo de insulina estimulada por glucosa (GSIS).
- La recuperación del injerto posibilita un análisis histológico y molecular exhaustivo tras el trasplante.
- Este protocolo proporciona un modelo preclínico reproducible para impulsar la investigación en terapia celular para la diabetes.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El trasplante intramuscular de células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas proporciona un modelo preclínico mínimamente invasivo y reproducible para el desarrollo de terapias celulares para la diabetes. Este enfoque permite la evaluación funcional de islotes derivados de células madre mediante la secreción de insulina estimulada por glucosa in vivo y facilita la recuperación confiable del injerto para análisis posteriores, abordando limitaciones clave de los sitios tradicionales de trasplante. El método aumenta la confianza predictiva en la evaluación preclínica al ofrecer un contexto fisiológico para la maduración y función de los islotes, al tiempo que mejora el acceso quirúrgico y reduce la invasividad en los animales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la valoración de la maduración funcional de islotes derivados de células madre en un contexto fisiológico.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante el injerto confiable y la secreción de insulina sensible a la glucosa en ratones inmunodeficientes.
- Valor estratégico: Facilita la confianza predictiva en la validación de dianas al proporcionar lecturas funcionales reproducibles antes de la optimización del compuesto líder.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la cribado de compuestos posteriores mediante el establecimiento de injertos de islotes funcionales.
- Valor operativo: Estandariza los procedimientos de trasplante para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad en estudios preclínicos.
- Valor estratégico: Mejora la disponibilidad del ensayo al permitir salidas funcionales cuantitativas mediante la SGIO in vivo para la evaluación del efecto de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia para la enfermedad al modelar la función de islotes humanos in vivo, lo que favorece la alineación de biomarcadores traslacionales.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la recuperación constante del injerto y el análisis histológico.
- Valor estratégico: Apoya las decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar datos funcionales y estructurales sobre el injerto y la maduración de los islotes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento al apoyar la prueba de hipótesis en las primeras etapas del descubrimiento, permitir la estandarización de ensayos para cribado y proporcionar lecturas funcionales que orientan las decisiones de identificación de compuestos prometedores y el avance preclínico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al evaluar la función de los islotes en un sitio de trasplante fisiológico.
- Examen: Mejora la preparación del ensayo mediante trasplantes estandarizados y mediciones reproducibles de la secreción de insulina estimulada por glucosa.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes mediante GSIS in vivo para comparar la función del injerto en diferentes condiciones.
- Investigación Traductiva: Se conecta con la continuidad preclínica al permitir el análisis histológico y molecular de los injertos recuperados para evaluar su maduración.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma preclínica reutilizable para ciclos iterativos de diseño y prueba en el desarrollo de terapias para la diabetes basadas en células madre.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en la función y maduración de islotes derivados de células madre.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los procedimientos de trasplante entre diferentes centros de investigación.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos funcionales confiables, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas de los programas contra la diabetes.
- Impacto en la cartera: Informa la priorización ajustada al riesgo mediante la validación reproducible del injerto y la función de islotes derivados de células madre.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en diferenciación de células madre, técnicas de trasplante microquirúrgico y pruebas metabólicas in vivo.
- Depende de una infraestructura quirúrgica estéril, sistemas de desafío con glucosa y ensayos de detección de insulina para obtener lecturas funcionales.
- Necesita una estandarización entre equipos que abarque el procesamiento celular, los procedimientos quirúrgicos y los equipos analíticos, para garantizar resultados consistentes.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes cepas de ratones inmunodeficientes y cronogramas de maduración de islotes.
- Está limitado por la necesidad de monitoreo postoperatorio y procedimientos de recuperación del injerto, lo que puede afectar el rendimiento en estudios a gran escala.
