Procedimientos para la identificación de inhibidores de entrada del SARS-CoV-2 como posibles antivirales utilizando pseudovirus basados en MLV

Nuestra investigación se centra en identificar inhibidores que bloquean la entrada del SARS-CoV-2 mediante sistemas pseudovirales. El estudio de la entrada en SARS-CoV-2 suele requerir laboratorios de alta bioseguridad en contención, normalmente BSL-3. Este protocolo permite un cribado antiviral seguro utilizado en pseudovirus en laboratorios estándar de BSL-2.

Para empezar, colocar una placa de cultivo de tejidos de seis pozos en el armario de bioseguridad y sembrar 7,5 por 10 a la potencia de cinco células derivadas de HEK 293 por pozo en dos mililitros de medio completo. Incuba la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, confirma que las células han alcanzado aproximadamente un 50-60% de confluencia.

Al día siguiente, prepara la solución de polietilenimina o PEI añadiendo cinco microlitros de un miligramo por mililitro de stock PEI a 50 microlitros de medio sérico reducido en un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. En un tubo microcentrífugo separado de 1,5 mililitros, prepara la solución de ADN añadiendo 2,5 microgramos de plásmido que expresa GFP a 50 microlitros del mismo medio. Mezcla cada tubo brevemente mediante vórtice, luego centrifuga durante cinco segundos e incuba a temperatura ambiente.

Durante el periodo de incubación de 10 minutos, retira cuidadosamente el medio de cada pozo de la placa de seis pozos sin alterar la monocapa celular y añade un mililitro de medio de transfección completo sin antibióticos a cada pozo. Tras la incubación, añadir 50 microlitros de la solución de ADN al tubo que contiene la solución PEI. Mezcla rápidamente pipeteando seis veces y incuba a temperatura ambiente durante exactamente tres minutos.

Luego añade rápidamente el complejo de ADN PEI gota a gota al pozo correspondiente. Ahora, sella los bordes de la placa con parafilm y centrifuga a 1000 G durante 30 minutos a temperatura ambiente sin interrupción usando un rotor oscilante y un cubo para placas. Tras la centrifugación, retira suavemente la parapelícula e incuba la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante tres horas.

Luego sustituye suavemente el medio de transfección en cada pozo por dos mililitros de medio DMEM completo precalentado. Incubar las células transfectadas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas y evaluar la eficiencia de la transfección mediante la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia. La semilla HEK 293T derivó las células en dos placas de 6 pozos, como se demostró anteriormente.

Designa una placa para la generación de pseudovirus de picos SARS-CoV-2 y la otra para pseudovirus VSVG. Prepara la mezcla de transfección y los complejos de ADN PEI el día del experimento e incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, retira cuidadosamente el medio de cada pozo de las seis placas sin alterar la monocapa celular.

Añade lentamente un mililitro de medio de transfección completa precalentado sin antibióticos a cada pozo, permitiendo que el medio corra por la pared del pozo. Añadir los complejos de transfección preparados a las células para transfectarlas, como se demostró anteriormente. Tras 48 horas de incubación post-transfección, recoge los supernadantes de cada pozo en un tubo cónico estéril de 50 mililitros y centrifuga a 290 G durante siete minutos a cuatro grados Celsius.

Recoge el sobrenadante libre de células y filúralo a través de una unidad de filtro estéril de 0,45 micrómetros con tapa de polivinilideno fluoruro. Preparar alícuotas de un mililitro del sobrenadante filtrado y almacenarlas a menos 80 grados Celsius Seed 2,5 por 10 a la potencia de cuatro células HSI, una línea celular altamente susceptible al SARS-CoV-2 en 50 microlitros de DMEM completo por pozo en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. Preparar y etiquetar pozos triplicados para cada condición a analizar, incluyendo infecciones por pseudovirus sin chispa y controles no infectados.

Incuba la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante la noche. El día de la transducción, descongelar una alícuota de cada lote pseudoviral sobre hielo y mezclar suavemente por inversión, incluyendo una alicota del control sin pinchos. Añadir los volúmenes necesarios de preparación pseudo-virus directamente a los pozos designados.

Ajusta el volumen de cada pozo a 150 microlitros con DMEM completo. Ahora, sella la placa con parafilm y centrifuga a 2.500 g durante 45 minutos a temperatura ambiente sin interrupción. Retira el sello de parafilm e incuba la placa durante 72 horas a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono.

Tras la incubación, prepare los reactivos del ensayo de luciferasa según las instrucciones del fabricante. Descongela el sustrato de luciferasa y el buffer de lisis del ensayo 5X luciferasa a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Diluye el buffer de lisis 5X del ensayo luciferasa a 1X con agua estéril.

Aspira cuidadosamente y descarta el sobrenadante. Después, añade 30 microlitros de tampón de lisis 1X a cada pozo. Coloca el plato sobre un agitador y agita durante 10 minutos a 150 revoluciones por minuto a temperatura ambiente.

Verifica la lisis celular completa bajo un microscopio invertido para confirmar que las células están completamente lisadas y no distinguibles. Luego transfiere los lisados a una placa blanca opaca de 96 pozos. Añade 50 microlitros de sustrato de luciferasa a cada pozo.

Mezcla brevemente moviendo suavemente la placa en círculos y coloca la placa en el luminómetro para medir la luminiscencia. Semilla 2,5 por 10 a la potencia de cuatro celdas HSI en 50 microlitros de DMEM completo por pozo en una placa de 96 pozos como se describió anteriormente. Incuba durante la noche a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono.

Al día siguiente, preparar una a tres diluciones en serie de los compuestos a probar, como el arbidol en DMEM completo que contenga 0,5% de dimetil sulfóxido. Utilizando una pipeta multicanal, aspira suavemente el medio de cada pozo. Añadir 50 microlitros de la dilución del compuesto correspondiente a cada pozo mientras se añade DMEM completo solo a los 12 pozos de control de la columna.

Incuba durante una hora a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono. Sin eliminar los compuestos, añadir directamente 50 microlitros de pseudovirus de pico SARS-CoV-2 a cada pozo diluido en un medio completo que contenga las mismas concentraciones de compuestos. Sella la placa con parfilm.

Centrifugar a 2.500 G durante 45 minutos a temperatura ambiente sin interrupción. Después de retirar la parfilm, incuba la placa a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. Finalmente, cuantifiquen la infectividad mediante un ensayo de luciferasa como se ha demostrado anteriormente.

La transfección de células derivadas de HEK 293T con PEI ramificado resultó en una alta eficiencia de transfección, resultando en aproximadamente un 70% de células positivas para GFP. 48 horas después de la transfección. La infección de células HSI susceptibles con cantidades decrecientes de pseudovirus de pico SARS-CoV-2 o pseudovirus VSVG mostró un aumento dependiente de la dosis en la luminiscencia con el aumento de la entrada de pseudovirus.

Los pseudovirus sin picos y las células no infectadas mostraron niveles muy bajos de luminiscencia. El compuesto arbidol fue probado por su capacidad para inhibir la entrada pseudoviral y produjo una clara inhibición de respuesta a la dosis de la actividad luciferasa generada por pseudovirus spike, observando menos inhibición en pseudovirus VSVG. El ensayo mostró un factor primo Z de 0,54, indicando idoneidad para fines de cribado.

El tratamiento con arbidol a concentraciones que partían de 30 micromolares no afectó significativamente la viabilidad celular en comparación con las células tratadas solo con vehículo de dimetilsulfóxido al 0,5%. Este protocolo permitió la producción de pseudovirus de alto título mediante condiciones optimizadas. Esto permite a los investigadores medir la entrada pseudoviral e identificar compuestos que inhiben la infección mediada por picos por SARS-CoV-2.

Una alta eficiencia de transfección es fundamental para generar pseudovirus de alto título y obtener señales de infección fiables en ensayos posteriores. Este sistema permite el cribado antiviral de alto rendimiento y la devaluación de inhibidores de entrada frente a variantes emergentes del SARS-CoV-2, y puede adaptarse fácilmente para generar pseudovirus que muestren proteínas envolvente de otros virus.