Mapeo genómico de modificaciones de histonas y sitios de unión a factores de transcripción en líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas neuroendocrinas utilizando CUT&RUN

Por tanto, el objetivo de nuestra investigación es identificar las interacciones entre los factores de transcripción que definen la línea y las proteínas de remodelación de la cromatina en los diferentes tipos de cáncer de pulmón de células pequeñas, en la regulación de los paisajes de transcripción y cómo estas interacciones pueden contribuir a procesos de la enfermedad, incluyendo la iniciación y progresión del cáncer. Nuestro objetivo es lograr esto realizando experimentos como CUT&RUN, que es una técnica de secuenciación de nueva generación capaz de perfilar o identificar a escala global las ubicaciones genómicas de donde estas histonas diferencialmente modificadas y factores de transcripción ligados al ADN. En última instancia, esperamos identificar nuevas vías que estén reguladas epigenéticamente y que puedan ser terapéuticas aplicables en el desarrollo de nuevos tratamientos para pacientes con esta forma tan agresiva de cáncer de pulmón.

Para empezar, retira las células neuroendocrinas de cáncer de pulmón de células pequeñas cultivadas de la incubadora a 37 grados Celsius y explínalas al microscopio para garantizar su calidad. Luego transfiere la suspensión de la celda a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifuga el tubo a 1.200 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspira el medio del tubo cónico usando el vacío de la campana y enjuaga el pellet celular resultante con 20 mililitros de PBS.

Centrifuga el tubo de nuevo a 1.200 g durante cinco minutos y aspira el PBS. Añade Accutasa según el tamaño de la cápsula e incuba durante tres a cinco minutos a 37 grados Celsius para digerir la cápsula celular. A continuación, termina la digestión añadiendo cinco mililitros de PBS con un 10% de FBS y mezclando para obtener una suspensión de célula única.

Tras centrifugar las células de nuevo, como se ha demostrado antes, resuspende el pellet en cinco mililitros de PBS. Cuenta las celdas iniciales y confirma su viabilidad e integridad usando el contador automático de celdas. Calcula el número total de celdas requeridas y añade un 20% de exceso para compensar los errores de pipeteo.

Transfiere el número total calculado de celdas a tubos de 1,5 mililitros y centrifuga los tubos a 600 g durante tres minutos a temperatura ambiente. resuspende las células en el buffer de lavado a una densidad de cinco por 10 a la potencia de cinco celdas por reacción, para un total de seis reacciones. Utiliza 100 microlitros de tampón por reacción y pipetea suavemente pero con cuidado para asegurar una suspensión uniforme.

Centrifuga las celdas de nuevo, quita el sobrenadante y repite el lavado. Alicuota 100 microlitros de las células lavadas en cada tubo de un juego de ocho tiras que contiene 10 microlitros de perlas activadas de Concanavalina A. Pipetea suavemente para mezclar el contenido.

Incuba la suspensión de las células de las perlas durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que las células se unan a las perlas, y gira rápidamente los tubos en una mini centrífuga para recoger la suspensión sin permitir que las perlas se asienten. Coloca los tubos en un portailes de imáns de 0,2 mililitros. Deja que la suspensión se disipe y haz una pipeta para eliminar el sobrenadante.

Luego quita los tubos del imán. Inmediatamente añade 50 microlitros de anticuerpos de anticuerpos helados a cada reacción y pipete suavemente para volver a suspender las perlas. Etiqueta adecuadamente los ocho tubos de tiras.

Añadir 0,5 microgramos de H3K4me3, H3K4me1 e inmunoglobulina G y 0,6 microgramos de anticuerpos policlonales E2F7 de diferentes fuentes a cada tubo de reacción. Pipetea suavemente para mezclar bien el contenido de cada tubo de reacción e incubarlo durante la noche en un nutator a cuatro grados Celsius con las tapas elevadas del tubo. Retira los ocho tubos tiras del nutador y realiza un giro rápido para recoger líquido en el fondo de cada tubo.

Ahora coloca los tubos en el soporte magnético hasta que la suspensión se disipe. Luego pipeteo cuidadosamente para retirar y desechar el sobrenadante. Manteniendo los tubos en el soporte magnético, lava cada tubo dos veces con 200 microlitros de tampón de permeabilización en celda fría y utiliza una pipeta de varios canales para eliminar el sobrenadante tras cada lavado.

Después, quita los tubos del soporte magnético. Inmediatamente añade 50 microlitros de tampón permeable a las celdas frías a cada reacción y pipetea suavemente para volver a suspender las células y las perlas. Luego añade 2,5 microlitros de proteína AG-micronucleasa a cada reacción y mezcla bien pipeteando suavemente.

Tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, realiza un giro rápido de los tubos. Vuelve a colocarlos en el soporte magnético hasta que la suspensión se disipe, y luego retira el sobrenadante. Después de lavar las perlas dos veces con un tampón de permeabilización de células en frío, resuspenderlas suavemente en 50 microlitros del tampón permeable de la celda.

Mientras mantienes los tubos en hielo, añade un microlitro de 100 milimolares cloruro de calcio a cada reacción en la tira de ocho tubos del paso anterior. Pipetea suavemente para resuspender completamente las perlas y promover una digestión eficiente. Incuba los tubos en un nutator a cuatro grados Celsius durante dos horas, manteniendo las tapas de los tubos elevadas durante toda la incubación.

Ahora, en un nuevo tubo de 1,5 mililitros, prepara la mezcla de tampón de parada combinando 33 microlitros de tampón de parada con un microlitro de escherichia coli spike en ADN a 0,5 nanogramos por reacción. Haz un vórtice suave para mezclar la solución. Al final de la incubación de dos horas, añade 33 microlitros de la mezcla de tampón de parada preparada a cada tubo de reacción y mezcle bien.

Incuba los tubos de reacción en un termociclador a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Tras una vuelta rápida, coloca los tubos sobre una estantería magnética hasta que la solución se despeje. Transfiere cuidadosamente aproximadamente 85 microlitros del sobrenadante que contiene el ADN de liberación CUT&RUN a tubos frescos de 1,5 mililitros.

Purificar el ADN recuperado, evaluar su cantidad y realizar la distribución del tamaño de los fragmentos para el control de calidad. Luego procede con la preparación de la biblioteca CUT&RUN, cuantificación, agrupación de bibliotecas indexadas y secuenciación de próxima generación con extremos emparejados. Líneas celulares altas del homólogo Achaete-scute 1, DMS79 y H146, y líneas celulares altas del Factor de Diferenciación Neurogénica 1, H82 creció como agregados no adherentes o esferoides compactos en suspensión, mientras que H446 mostró morfología mixta, con aproximadamente un 80% de células inherentes y un 20% en suspensión.

El análisis de fragmentos de ADN CUT&RUN reveló que la marca de histonas potenciadora H3K4me1 produjo las mayores cantidades de ADN en todas las líneas celulares, seguida por H3K4me3, siendo E2F7 e IgG las cantidades más bajas. Para el ADN extraído de CUT&RUN, la distribución del tamaño de los fragmentos para H3K4me1 y H3K4me3 mostró picos claros para mononucleosomas y dinucleosomas junto con ADN genómico. En contraste, no se detectaron picos distintivos para E2F7 ni para el control de IgG.

A pesar de la baja entrada de ADN, se construyeron con éxito bibliotecas de secuenciación de nueva generación para todos los objetivos CUT&RUN, incluyendo E2F7 e IgG. El análisis de mapas térmicos en células mutantes tipo salvaje DMS79 y mutantes heterocigotas H146 mostró que las señales H3K4me3 y E2F7 estaban enriquecidas cerca de los puntos de inicio de la transcripción, mientras que las señales H3K4me1 estaban más ampliamente distribuidas. La visualización del navegador genómico en una región de cromatina seleccionada aleatoriamente mostró picos distintos para H3K4me3, H3K4me1 y E2F7, mientras que IgG no mostró enriquecimiento.

Por eso, tradicionalmente, científicos e investigadores han utilizado inmunoprecipitación con cromatina seguida de secuenciación o ChIP-seq para abordar preguntas como las que planteamos. Sin embargo, ChIP-seq requiere una cantidad bastante alta de materiales de entrada, lo cual no siempre es factible, dependiendo del modelo que se utilice. CUT&RUN, en cambio, requiere significativamente menos material de entrada, tan solo 50.000 celdas, y requiere lecturas de secuenciación de alto rendimiento menores, lo que significa que es menos costoso y produce mucho menos fondo en cuanto a generación de datos.

CUT&RUN es una técnica que puede aplicarse no solo a células en cultivo 2D, sino que también puede adaptarse a otros modelos preclínicos, como organoides derivados de pacientes y xenoinjertos. También puede utilizarse para perfilar el paisaje de cromatina en tejidos, incluyendo tanto tejidos normales como enfermos. Así que esta es una tecnología o técnica increíblemente útil para los investigadores del cáncer, pero también puede ser muy útil para investigadores no relacionados con el cáncer que se centran en estudiar diferentes enfermedades humanas.

Este protocolo permite un mapeo de las modificaciones de las histonas y los perfiles permanentes de las diversas proteínas in situ en el genoma celular. Proporcionar PTMs de histonas y la unión de la TF entre subtipos de SCLC puede revelar genes específicos de subtipo y elementos reguladores, como potenciadores y superpotenciadores.