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Artículo de investigación
La curcumina (CUM) inhibe la progresión del glioblastoma (GBM) induciendo la cuproptosis mediante la supresión del eje AKT/Wnt/β-catenina. Este protocolo investiga el mecanismo molecular por el cual el CUM impide la progresión maligna en la GBM y describe métodos para evaluar cómo el CUM induce la cuproptosis modulando esta vía.
La curcumina (CUM) puede regular el comportamiento maligno del glioblastoma (GBM). Este estudio investiga si el CUM suprime la progresión del GBM induciendo la cuproptosis a través de la vía de señalización AKT/Wnt/β-catenina. Las concentraciones óptimas de curcumina se determinaron mediante el ensayo MTT. Las células A172 y U251 fueron tratadas con CUM, inhibidor de AKT MK-2206, inhibidor de Wnt LGK974 y Elsm-Cu (Elesclomol +CuCl 2). La proliferación, migración, invasión y apoptosis celular se evaluaron utilizando tinción con aminoésteres de succinimidil de carboxifluoresceína, ensayos scratch, ensayos de Transwell y citometría de flujo, respectivamente. Se utilizaron fluorescencia MitoSOX, análisis metabólico de caballitos de mar, inmunofluorescencia, detección de Cu2+ y Western blot para evaluar el estrés oxidativo mitocondrial y la cuproptosis. El eje AKT/Wnt/β-catenina se analizó utilizando un kit de reportero TCF/LEF1 y western bloting. Se estableció un modelo de xenoinjerto de GBM y se administró CUM por gavage durante cinco semanas. Se evaluaron los efectos del CUM sobre el crecimiento tumoral, la cuproptosis y la expresión de proteínas de la vía AKT/Wnt/β-catenina. Las células fueron tratadas con 10 μM y 20 μM de CUM in vitro. El tratamiento con CUM redujo la proliferación, migración e invasión, al tiempo que promovía el estrés oxidativo y la cuproptosis. El CUM también suprimía la actividad de señalización Wnt/β-catenina. La inhibición de las vías aumentó los niveles de especies reactivas de oxígeno (3,7 veces) y de Cu2+ (3,1 veces), y disminuyó la expresión de la dihidrolipoamida acetiltransferasa, restringiendo así el comportamiento maligno. En ratones desnudos, el CUM redujo significativamente el crecimiento tumoral, promovió la cuproptosis e inhibió la activación del eje AKT/Wnt/β-catenina. Nuestros resultados indican que el CUM suprime la señalización de AKT/Wnt/β-catenina, promueve la cuproptosis e interfiere con la progresión del GBM.
El glioma es el tumor maligno intracraneal primario más prevalente en el sistema nervioso central (SNC)1. El glioma de grado 4 suele referirse a glioblastoma (GBM), con unpronóstico 2 deficiente. La GBM es un tumor cerebral altamente invasivo, que representa casi el 50% de las malignidades del SNC, con una supervivencia media inferior a 1año 3. Es conocida por su alta malignidad y alta tasa derecurrencia 4,5. Actualmente, las estrategias de tratamiento de la GBM se basan principalmente en la cirugía, compl....
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Todos los procedimientos animales se realizaron en cumplimiento de los estándares institucionales establecidos para el cuidado y uso humanitario de animales de laboratorio y fueron aprobados formalmente por el Comité de Ética Animal de la institución. Se tomaron medidas para reducir las molestias y el malestar de los animales siempre que fuera posible.
El trabajo que involucraba compuestos químicos, colorantes y muestras biológicas siguió las prácticas establecidas de bioseguridad para mitigar los riesgos potenciales. Las sustancias potencialmente peligrosas —incluyendo paraformaldehído, reactivos a base de cobre y DHE— se manipularon con e....
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Inhibición de la viabilidad celular GBM y muerte celular inducida
En primer lugar, no hubo un cambio significativo en la viabilidad de las células NHA tras 2 horas, 48 horas y 72 horas de intervención con CUM (Figura 2A), lo que indica que las concentraciones de CUM utilizadas no tuvieron efecto tóxico sobre las células normales. En cambio, la viabilidad de las líneas celulares de GBM (A172, U251, LN229 y SHG-44) se redujo significativamente a concentraciones de CUM ≥ 1 μ.......
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La tasa de recurrencia de la GBM está asociada con sus características biológicasmalignas 36. El CUM ejerce efectos anti-GBM regulando el estrés oxidativo, la apoptosis, la autofagia, la metástasis, la invasión y los principales objetivosmoleculares 37. En este estudio, experimentos a nivel celular demostraron que el CUM aumentó significativamente la mortalidad celular del GBM e inhibió la proliferación, formación de colonias, migración e i.......
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Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de tinción de violeta cristalino al 0,1% | Servicebio | G1014 | Celdas de marcado |
| 4% de paraformaldehído | Beyotime | P0099 | Reparar células o tejidos |
| Inhibidor de AKT (MK-2206) | Selleck.cn, Shanghái, China | S1078 | Inhibidor específico de AKT |
| Anticuerpos (anticuerpos primarios y secundarios) | Tecnología ABclonal, Wuhan, China / abcam, Cambridge, Reino Unido / Servicebio, Wuhan, China / Beyotime, Shanghái, China / Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU. | A8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025 | Detección de los niveles de expresión proteica |
| Kit de detección de apoptosis celular | Servicebio, Wuhan, China | G1021 | Detección de apoptosis |
| Tinte Cell Trace CFSE | Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU. | C34570 | Detección de proliferación celular |
| Sistema de imagen quimioluminiscencia | Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU. | Chemi Doc XRS+ | Detección de ultra alta sensibilidad de proteínas |
| Kit de ensayo colorimétrico Cu2+ | Elabscience, Wuhan, China | E-BC-K300-M | Detección de contenido de Cu2+ en tejidos tumorales y células GBM |
| CuCl2 | Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania | 751944 | Inductor de cuproptosis |
| Curcumina (CUM) | Hoja fuente de Shanghái, Shanghái, China | S19245 | Compuesto polifenólico |
| Kit de detección DHE | Beyotime, Shanghái, China | S0063 | Detección de niveles ROS |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Servicebio | G4101-2 | Disolvente para el ensayo MTT |
| Desarrollador ECL | Servicebio | G2161 | Uso para Western blot |
| Elesclomol | Selleck.cn | S1052 | Inductor de cuproptosis |
| Citometría de flujo | BD Biociencias, Nueva Jersey, EE. UU. | BD FACSAria III | Utilizado para ensayos de muerte celular y CFSE |
| Microscopio de fluorescencia | OLYMPUS, Tokio, Japón | IX73 | Utilizado para ensayos de inmunofluorescencia, ROS, TUNEL, DHE y MMP |
| Líneas celulares de glioblastoma A172 (RRID: CVCL_0131), U251 (RRID: CVCL_0021), LN229 (RRID: CVCL_0393) y SHG-44 (RRID: CVCL_6902) | Punosai Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, China | CL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207 | Líneas celulares de glioblastoma humano |
| Software GraphPad Prism 9.0 | GraphPad Software, LLC | Versión 9.0 | Análisis estadístico |
| Software ImageJ 1.53k | Instituto Nacional de Salud Mental | Versión 1.53k | Cálculo estadístico |
| Solución funcional JC-1 | Solarbio, Pekín, China | M8650 | Detección de MMP |
| Ratones machos BALB/c desnudos | Slack Kingda Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, China | Experimento con ratones | |
| Lector de microplacas | Bio-Tek, Vermont, EE. UU. | ELX-800 | Para la medición del valor OD450 nm |
| Microscopio | OLYMPUS | BX53 | Utilizado para pruebas de rayado celular, experimento de Transwell y ensayos de inmunohistoquímica |
| Sonda MitoSOX | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. | M36008 | Utilizado para la detección de ROS |
| Mitotracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | Marcado específico de mitocondrias en células vivas |
| Kit de detección de MTT | Servicebio | G4101-1 | Detección de la viabilidad celular |
| Células normales de astrocitos cerebrales humanos (RRID:CVCL_B0DK) | Huatuo Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, China | HTX2408 | Línea celular para experimentos de control |
| Kit de extracción de proteínas nucleares | Beyotime | P0027 | Extracción de proteínas nucleares |
| Analizador de metabolismo energético de células de caballito de mar | Agilent, Pekín, China | Seahorse XF | Utilizado para la detección de OCR |
| Kit de reportero luciferasa TCF/LEF1 | Biolab Technology Co., Ltd, Pekín, China | Detección de la actividad de la vía de señalización Wnt/β-catenina | |
| Kit de detección TUNEL | Beyotime | C1088 | Detección de apoptosis en tejidos tumorales |
| Inhibidor de Wnt (LGK974) | Selleck.cn | S7143 | Inhibidor específico de Wnt |
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