Validación del sistema de presión hiperbárica con anestesia de xenón para Drosophila melanogaster

Mi investigación busca entender cómo funciona la anestesia general, y hay varios gases que son anestésicos en condiciones hiperbáricas. Este protocolo nos permite anestesiar moscas de la fruta con xenón para estudiar el mecanismo básico de la anestesia general. Para empezar, recoge 20 moscas hembras y machos de Drosophila melanogaster anestesiadas, de entre uno y tres días, para cada experimento, y déjalas reposar en un vial con comida durante al menos 24 horas antes del experimento, a una temperatura de unos 22 grados Celsius.

Transfiere los gases de sus cilindros de contenedor a bolsas de gas impermeables para uso experimental. Usando tubería de silicona, conecta directamente la salida del cilindro de gas a la entrada de la bolsa de gas para permitir la transferencia de gas. Conecta un tubo de silicona de 25 milímetros de largo a una jeringuilla de polipropileno.

Conecta la jeringuilla de polipropileno a las bolsas de gas y al grifo de tres vías. Para montar el montaje hiperbárico, primero coloca la mesa de luces LED en orientación horizontal sobre la mesa. Coloca la bomba de inyección junto a un lado corto de la mesa de luz LED, orientada de modo que la jeringuilla experimental, al colocarla, sobresalga por encima de la luz de fondo.

Ahora, corta un tubo de silicona de 75 milímetros de largo. Conecta la toma de tres vías al manómetro usando el tubo de silicona de la boquilla central. Utiliza abrazaderas de resorte en la boquilla del manómetro y el grifo de tres vías en la parte superior para asegurar que el tubo esté bien sujeto.

Luego, utiliza el botón marcado con una doble flecha en la unidad de control de la bomba de inyección para ajustar la velocidad a 80 milímetros por minuto y la duración a 38 segundos para compresión o descompresión automática del émbolo. A continuación, limita la luz ambiental en la sala de experimentos y enciende la mesa de luces LED. Pon el nivel de brillo en tres para aumentar el contraste del vídeo.

Quita el émbolo de la jeringuilla de policarbonato. Inserta una pequeña cantidad de algodón en la punta de la jeringuilla para evitar que la mosca se escape. Para transferir 40 moscas a la jeringuilla de policarbonato, retirar la tapa del frasco, colocar el cilindro de la jeringuilla sobre el vial, invertir el conjunto y tocar para mover las moscas dentro del barril.

Orienta la jeringuilla de modo que las marcas del cañón estén orientadas hacia la cámara para una visualización óptima de las moscas. Fija la jeringuilla fijando tanto el cañón como la cabeza del émbolo a la bomba de inyección usando los tornillos ajustables. Ahora, retira el algodón de la punta de la jeringuilla y conecta la jeringuilla al grifo de tres vías.

Inicia la grabación de vídeo. Enciende el manómetro, luego gira el tope para conectar el manómetro con la jeringuilla y confirma la presión kilopascal cero. Gira la toma de tres vías hacia la posición lateral para permitir el intercambio de aire con la jeringuilla.

Usando la opción de control manual de la bomba de inyección, mueve el émbolo del marcador de 20 millitros a la marca de 2 mililitros. Aspira 18 mililitros de gas anestésico de la bolsa de gas en la jeringuilla de polipropileno. Conecta la jeringuilla al puerto lateral de bloqueo del señuelo de la toma de tres vías.

Luego, usa la opción manual de la bomba de inyección para mover el émbolo de nuevo a los 20 mililitros. Gira el tope para conectar el manómetro con la jeringuilla y observa la lectura de presión. Inicia el movimiento automático del émbolo con los ajustes preestablecidos de velocidad y duración.

Deja que el émbolo alcance la marca de los cinco mililitros en 38 segundos mientras controlas la presión. Deja el émbolo en la posición de cinco mililitros durante 20 segundos y anota la presión máxima. Golpea suavemente la jeringuilla para desalojar las moscas que se adhieren al émbolo y deja que se asienten en el fondo.

Inicia la descompresión automática después de 20 segundos. Termina el experimento cuando el émbolo vuelva a los 20 mililitros y registra la presión final para el control de fugas. Abre ScreenFlow para editar los vídeos.

Recorta cada vídeo grabado en la región de interés correspondiente a los primeros cinco mililitros del barril de la jeringuilla. Reduce cada vídeo a los primeros 20 segundos tras la descompresión con jeringuilla. Exporta los vídeos como GIFs y duplícalos.

Ahora, lanza el software Fiji para eliminar el primer y último fotograma de diferentes duplicados. Secuencialmente, haz clic en imagen, edición de vídeo y elimina fotogramas. Haz clic en proceso, binario y haz binario de cada archivo GIF en binario para que las moscas parezcan blancas sobre fondo negro.

Abre ambos archivos binarios en Fiji. Calcula la diferencia de píxeles entre ellos seleccionando calculadora de proceso e imagen para generar un archivo de diferencia de píxeles. Después de guardar el archivo de diferencia de píxeles, selecciona analizar y analizar partículas, ajustando los umbrales de tamaño de píxeles para mejorar la relación señal-ruido.

Guarda el archivo CSV generado que contiene las diferencias de píxeles por fotograma. Utiliza los datos para calcular el movimiento acumulado entre tramas para la comparación estadística. Los vídeos experimentales se procesaban convirtiéndolos en imágenes binarias y de diferencias para prepararse para el análisis de píxeles.

Sin umbral, las diferencias de píxeles se acumulaban a lo largo de los fotogramas y elevaban la señal base a aproximadamente 20.000. Aplicar un umbral de tamaño de píxel de 100 a 1000 reducía la señal de fondo y enfatizaba las diferencias causadas por el movimiento de la mosca. Los valores de diferencia de píxeles por fotograma se mantenían cerca de cero antes del fotograma 200.

El modelo YOLOv11 N seguía las moscas con alta precisión por fotograma, pero las oclusiones frecuentes provocaban asignaciones excesivas de identificación de moscas. Debido a inconsistencias en el seguimiento, el movimiento de la mosca se cuantificó sumando todos los movimientos de DI por experimento y normalizándolo con un máximo de 200 IDs. Las moscas expuestas al 85% de xenón se recuperaban más rápido y se movían más que las expuestas al 90% o 95% de xenón.

Nuestro protocolo ofrece simplicidad y rapidez, y utiliza materiales más baratos que las cámaras de presión tradicionales. La presión máxima está limitada a aproximadamente cuatro atmósferas, y un sellado imperfecto provoca una pérdida gradual de presión. Este sistema permite mediciones reproducibles de los efectos de los gases anestésicos en el comportamiento en pequeños organismos modelo.