Transformación eficiente basada en regeneración mediada por agrobacterias de una especie anfibia asexual de Brassicaceae, Rorippa aquatica

Abordamos la falta de una tubería sencilla y escalable para la transformación de agrobacterias para plantas asexuales, permitiendo análisis moleculares de las funciones génicas. Recientemente, estudios de expresión génica integral y genoma fisiológico introdujeron a rorippa aquatica como modelo para la heterofilia. Es útil para estudiar la base molecular de la adaptación de la tierra al agua.

Para empezar, selecciona plantas de dos meses que presenten hojas sanas con márgenes enteros. Prepara una bandeja de propagación de plantas, de 20 por 30 centímetros, con dos capas de papel de cocina autoclave. Dobla cuidadosamente las toallas de papel y empálalas con agua estéril hasta que quede una fina capa de agua en la superficie.

Asegúrese de que el banco de laboratorio esté equipado con entre 100 y 500 mililitros de agua doble destilada, recipientes estériles adecuados para el volumen previsto de inóculo resuspendido, una micropipeta y puntas adecuadas para la pipeta. Ahora, elimina rápidamente 10 hojas en la base de pétalos de las plantas seleccionadas usando tijeras y colócalas en una placa de Petri con agua estéril. Tras 2,5 horas, se pipeten 50 microlitros de tensioactivo por litro de solución de resuspensión para alcanzar una concentración de tensioactivo del 0,005%.

Haz girar suavemente el matraz para mezclar la solución y asegúrate de que haya una bandeja de propagación preparada disponible para la colocación del explante tras la inoculación. Ahora coloca una hoja con el lado de la axilla hacia arriba. Con un bisturí, corta perpendicularmente a lo largo de la costilla media de la hoja en piezas de un centímetro de longitud y colócalas en un tubo de 50 mililitros adecuado para usarse en un mezclador de tubos giratorios que sirva como explantaciones de inoculación.

Vierte el inóculo agrobacterium en el tubo a un volumen suficiente para saturar completamente todo el material explantado. Coloque el tubo sobre una batidora rotatoria y agite a temperatura ambiente durante 10 minutos para realizar la inoculación. Luego, usando pinzas, retira todos los explantes de hojas inoculados de la solución y colócalos directamente en la bandeja de propagación preparada.

Separa y extiende los explantes remojados de forma uniforme para que queden parcialmente sumergidos pero no completamente sumergidos en la fina capa de agua sobre las toallas de papel saturadas. Después, sella la bandeja de propagación con film plástico. Coloca las bandejas en un ambiente oscuro e incuba a una temperatura ambiente de 22 grados Celsius durante tres días.

Tras completar el periodo de incubación en oscuridad, confirma que las bandejas permanezcan selladas con film transparente. Luego añade agua destilada doblemente a las bandejas según sea necesario para mantener los niveles de humedad. Transfiere las bandejas de inoculación a una cámara de crecimiento y mantenlas bajo condiciones de propagación vegetativa.

Inspeccionar visualmente las plantas rosetas regeneradas para verificar su idoneidad para el trasplante. Identificar el ideal confirmando la presencia de un conducto intacto con múltiples hojas y raíces que miden al menos dos o tres milímetros de longitud. Luego, extirpa las plantas de roseta transgénica intactas usando pinzas.

Trasplante las plantas extirpadas bajo las mismas condiciones utilizadas para las regeneraciones clonales de tipo salvaje. Extirpe una roseta encendida evitando cuidadosamente el contacto con cualquier hoja transgénica. Recorta el follaje sobrante inmediatamente que rodea la hoja transgénica y trasplanta una sola planta por maceta.

Después de fertilizar cada planta trasplantada, riegala bien, rocía el follaje y coloca las plantas bajo las condiciones adecuadas. Finalmente, devuelve el explante que contenga transformantes que carezcan de brotes y raíces o que parezcan demasiado pequeños para trasplantarlos a la bandeja de propagación. Continúa cribando estos explantes y trasplántalos una vez que hayan crecido lo suficiente.

La mayoría de un mes de edad, nuestras plántulas de un solo Tone mostraron patrones de expresión quiméricos de rubí, mientras que un pequeño número mostró hojas completamente de rubí. Madura de seis meses, nuestra plántula de 1 Tone mostró expresión quimérica de rubí. Los sectores foliares quiméricos pigmentados en rubí extirpados de nuestras plántulas de un T eran capaces de propagarse asexualmente.

Las hojas quiméricas extirpadas se regeneraron en forma de expresión completamente rubí o quimérica, nuestras plantitas de una roseta de una T y una en dos o cuatro semanas tras la excisión con formación visible de raíces durante la regeneración. Tras un mes, la mayoría de nuestras dos plántulas de Tone mostraban predominantemente hojas rubí. Nuestro protocolo evita los pasos de cultivo de tejidos estériles y proporciona una cadena de regeneración de transformación para plantas asexualmente propagadas vegetativamente sin semillas ni flores.

Nuestros estudios sobre la activación de las vías del etileno en Rorippa aquatica bajo sumergida proporcionan información clave sobre las respuestas de inmersión de las plantas terrestres. Nuestro método abre la puerta a investigar cómo las vías de la luz y las hormonas permiten que esta planta anfibia se metamorfosee bajo el agua.