Localizada RNAi y la expresión génica ectópico en la sanguijuela medicinal

La sanguijuela medicinal es un sistema modelo útil para estudios neurobiológicos debido a su simplicidad, accesibilidad y a la posibilidad de identificar neuronas estáticas con muchas herramientas experimentales diferentes, desde la embriogénesis temprana hasta la vejez. Un uso particularmente interesante de la sanguijuela embrionaria es para estudios de imágenes de lapso de tiempo del crecimiento neuronal en el animal intacto y vivo, tras modificaciones muy precisas de la expresión génica en la neurona objeto de estudio o en sus dianas. En este video, demostramos una tecnología novedosa para la administración rápida, precisa y altamente localizada de reactivos en las capas internas de embriones vivos de la sanguijuela, utilizando una pistola neumática de capilares desarrollada en colaboración entre el laboratorio de Alex Grossman y nuestro laboratorio.

Aunque esta técnica puede aplicarse a la entrega de ADN de doble cadena, ARN bicatenario o cualquier otra molécula que pueda cargarse en partículas microscópicas de oro, la utilizaremos tanto para el silenciamiento como para la introducción del gen de la molécula de guía axonal Rin. Hola, soy del laboratorio de Eduardo Ano en la División de Ciencias Biológicas de la Universidad de California en San Diego. Hoy les mostraremos un procedimiento para reducir o introducir la expresión de la molécula de guía axonal denominada networking, que se expresa naturalmente en la pared ventral del cuerpo, pero no en el dominio dorsal de todos los segmentos corporales de la lech.

Introduciremos moléculas de ARN bicatenario o ADN plasmídico en la pared corporal y en los ganglios de segmentos seleccionados en estadios tempranos de desarrollo. La administración integral mediante pistola neumática de capilar es particularmente importante porque permite alterar los patrones de expresión génica en áreas seleccionadas del subsegmento, dejando los segmentos no tratados como control interno. Además, puede utilizarse para alcanzar capas internas de células en estadios tempranos de desarrollo sin dañar el tejido y sin abrir el espécimen.

Por último, la administración holística tiene la ventaja de poder dirigirse a un número limitado de células en una ubicación seleccionada, intermedia entre la inhibición de una sola célula mediante microinyección y la inhibición sistémica mediante enfoques genéticos. Así que comencemos. El LE medicinal se ha utilizado ampliamente para estudiar las propiedades de las células nerviosas y los circuitos neuronales relacionados con el comportamiento debido a la simplicidad del sistema nervioso central, con aproximadamente 200 pares bilaterales de neuronas y un pequeño conjunto de glía gigante.

Cada ganglio segmentario de los 21 segmentos corporales, así como cada neurona de la sanguijuela, puede identificarse y estudiarse repetidamente de espécimen a espécimen, desde el embrión temprano hasta el adulto mayor. Desde la época de los faraones, la sanguijuela se ha utilizado con fines de sangría, y su uso continuo en medicina la hace fácilmente disponible a través de proveedores comerciales de animales. Sin embargo, dado que estudiamos el desarrollo del sistema nervioso, mantenemos en nuestro laboratorio una colonia reproductora de varias cientos de sanguijuelas, lo que nos proporciona un suministro constante de embriones para nuestros experimentos.

Las sanguijuelas son hermafroditas. Poseen estructuras tanto femeninas como masculinas y se fertilizan cruzadamente. Por lo tanto, todos los especímenes pueden poner huevos.

Ellos lo hacen dentro de una estructura denominada capullo, que fabrican ellos mismos utilizando un conjunto de glándulas especiales que segregan polímeros muy interesantes en una región del cuerpo conocida como el ctenidio. Cuando está lista para poner huevos, una sanguijuela se entierra en musgo, que proporcionamos en los tanques, y comienza a formar este capullo con forma de huevo alrededor de su cuerpo; cuando se ha segregado suficiente material y las moléculas han comenzado a polimerizarse, la sanguijuela deposita los huevos, así como una yema nutritiva en el interior del capullo, y luego se retuerce para salir. Usando una cuchilla de afeitar, podemos extraer los embriones cortando una abertura en uno de los extremos de un capullo.

Por lo general, cada capullo contiene entre 10 y 20 embriones a partir de aproximadamente el sexto día después de que comienzan a diferenciarse. Los embriones pueden extraerse del capullo y criarse en agua de estanque. Son en estas etapas cuando generalmente iniciamos nuestros estudios experimentales sobre el desarrollo neuronal.

El primer paso importante en este procedimiento es la preparación de partículas recubiertas. En esta demostración, mostraremos cómo entregar partículas de oro recubiertas con moléculas de ARN bicatenario del homólogo lech de la molécula de guía axonal rin en embriones de lech. Las células diana son las células musculares longitudinales ventrales en la pared corporal, las cuales se sabe que expresan y liberan Rin a partir de las primeras etapas de la Agenesis.

Nuestro objetivo es reducir la expresión natural en un solo segmento corporal lo antes posible durante el desarrollo, y observar cómo esto afecta a las categorizaciones de neuronas que son sensibles a este factor de desarrollo importante. Para este paso, se necesita un baño de sonicación, un vórtex, una centrífuga de banco y un cubo de hielo. También se requiere isopropanol al 100%, que debe enfriarse en hielo antes de usarlo.

Comience con 100 microlitros de tampón de unión que contiene 50 miligramos de partículas de vault por mililitro. Estas partículas están diseñadas para ARNi y son fabricadas por la empresa chell. A continuación, diluya la solución de partículas agregando 100 microlitros de tampón de unión, vortexee brevemente y sonique durante uno a dos minutos para separar las partículas que pudieran haberse agrupado.

Después de la sindicación de dos minutos, agregue de cinco a 10 microgramos de ARN bicatenario a las partículas, vortexee y deje a temperatura ambiente durante dos minutos. Ahora que han transcurrido los dos minutos, centrifugue los complejos de partículas de ARN bicatenario a un mínimo de 2.500 RPM en la microcentrífuga durante aproximadamente 15 segundos.

Para obtener el pt, retire el sobrenadante y agregue 750 microlitros de isopropanol al 100 % frío con una perturbación mínima del pellet. Centrifugue brevemente en un microcentrífuga y retire el sobrenadante después de la centrifugación. Suspenda las partículas de oro en isopropanol al 100 % frío mediante sonicación. Aplique brevemente dos o tres pulsos en el mejor sonificador para separar las partículas.

Vierta sobre un portaobjetos de vidrio y deje que el disolvente evapore completamente. Los mejores resultados se obtienen cuando las partículas se recubren justo antes de su administración al tejido, lo cual es lo que le mostraremos cómo hacer en el siguiente paso. Antes de realizar la transfección balística, echemos un vistazo al montaje experimental y a cómo prepararlo.

La pistola capilar neumática está montada sobre un micromanipulador para la administración precisa de partículas en los embriones. La superficie del embrión se imagina con un microscopio de video. Un láser de semiconductor genera un haz de luz dirigido a través del capilar interno de la pistola y se utiliza para apuntar al tejido objetivo.

Líneas separadas de tubos Titan conectadas a las tres entradas del cabezal de la pistola proporcionan gas helio presurizado desde una única fuente. Una línea está siempre abierta, creando un flujo continuo de gas helio a través de la pistola. Las otras dos líneas normalmente están cerradas mediante una válvula solenoide y contienen partículas de oro con dos recubrimientos diferentes que fueron cargadas en el tubo.

Como un polvo seco. La capilar externa de la pistola está conectada a un sistema de vacío con una presión manométrica de menos 12,5 PSI. La presión de cabeza de hi se varía entre 10 y 15 PSI para ajustar la profundidad deseada de penetración de partículas.

La presión del cabezal de helio puede afectar considerablemente la profundidad de penetración de las partículas, al igual que la distancia entre el embrión y la pistola. El diámetro de la boquilla, que varía entre las diferentes pistolas de genes, es importante seleccionarlo en función del área objetivo. Ahora que hemos mostrado nuestro montaje experimental, carguemos nuestra pistola Jing y disparemos sobre algunos embriones de lech.

Antes de cargar el tubo Titan, es fundamental que las partículas de oro recubiertas estén completamente secas. Primero se raspan las partículas de oro recubiertas de las laminillas de vidrio utilizando una cubreobjetos o una cuchilla de afeitar, y se preparan para cargarlas en el trozo doblado de papel de suero. El tubo debe doblarse en forma de U cerca del conector para que, al cargarse, las partículas no se extiendan a lo largo de todo el tubo, sino que se concentren cerca del conector.

Recoge las partículas con una espátula pequeña o con un trozo de papel de pesaje en forma de V y carga el tubo. Golpea ligeramente el tubo con el dedo durante la carga para distribuir las partículas de manera uniforme. Después de cargar el tubo, ahora podemos pasar a la entrega del ARN bicatenario mediante la pistola Jing, pero no antes de preparar nuestras sanguijuelas.

Aquí puede observar nuestros embriones de sanguijuela, que tienen aproximadamente 10 días de edad. Ahora se encuentran en medio estéril, en el cual se mantendrán tanto antes como después de la administración de ARN bicatenario. El primer paso para preparar los embriones experimentales para la administración de ARN bicatenario consiste en añadir una solución de 8% de etanol en medio estéril a una pieza plana de silicona flexible con una ranura en forma de V.

Se añade un embrión y se coloca inmediatamente con la cara ventral hacia arriba antes de disparar las partículas. El medio en la cámara se reduce justo por debajo de la superficie superior del embrión, y se coloca encima un trozo de papel de filtro con un pequeño orificio en el centro para estabilizarlo y evitar que su superficie se seque, al tiempo que expone únicamente la zona que será irradiada en la etapa embrionaria que estamos utilizando hoy. En la etapa E 10, las células del músculo longitudinal pueden localizarse aproximadamente entre 10 y 20 micrómetros por debajo de la superficie externa, internas a la epidermis, la dermis y los músculos circulares.

A diferencia de las células musculares, los ganglios centrales en el lado ventral de los embriones en las etapas embrionarias, con los que trabajamos desde E siete hasta E 12, se encuentran a unos 50 micrómetros de profundidad dentro de la superficie ventral del cuerpo. Ajustaremos la presión de helio para dirigirnos a los músculos longitudinales, que se encuentran a una profundidad más superficial que los ganglios. Ahora estamos listos para disparar partículas de oro contra los músculos longitudinales.

Una carga de partículas de oro que pesa aproximadamente medio miligramo normalmente puede utilizarse para hasta 10 disparos, siendo habitual que cada disparo entregue del orden de unas pocas cientos de partículas. Un disparo se genera al abrir brevemente una de las válvulas durante 0,3 segundos, lo que provoca la inyección de un bolo de partículas desde la línea de tubo correspondiente hacia el interior del cañón. Para cubrir el área de tejido de interés, a menudo se requieren múltiples disparos.

El tubo se golpea suavemente entre disparos para desalojar algunas partículas y facilitar su inyección en la corriente continua de helio dentro del cañón. Si se desea administrar un segundo reactivo en el mismo ensayo, se pueden cargar partículas alternativas en un segundo tubo inmediatamente después de la administración de las partículas de oro. Los embriones se devuelven al agua artificial de estanque, preferiblemente un embrión por placa, durante uno a tres días, hasta que se considere suficiente la interferencia del ARN o la expresión ectópica.

Durante este tiempo, los embriones se mantienen en una cámara oscurecida a temperatura ambiente. A continuación se muestra un análisis de hibridación con ceto para narina, inhibición de ARNm. Puede observarse que en el embrión tratado, pocas células musculares no expresan terrina.

Estos músculos contienen partículas. Puede observarse que cuando las partículas estaban recubiertas con ARN bicatenario de terrina, provocan una reducción claramente visible de la expresión de narin, que solo ocurrió en células que contenían partículas, generalmente de una a dos partículas por célula. Cuando se codifican partículas con un plásmido que codifica para GFP, se obtiene fluorescencia en células neuronales cuando se detienen en sus núcleos con la pistola neumática de capilares que utilizamos.

En esta demostración, pudimos introducir ambas partículas en las células dentro de un pequeño volumen localizado de un embrión vivo sin causar daño detectable a las células en la zona objetivo. También les hemos mostrado cómo la pistola capilar nómada otorga a la técnica la capacidad de administración integral y una nueva posibilidad de activar y silenciar genes en una región microscópica de un tejido confinado en tres dimensiones y dirigido con alta precisión, sin daño detectable al tejido. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.