Análisis de ADN microbiano en el campo utilizando un kit de extracción biológica de campo y una unidad qPCR de campo

El alcance de nuestra investigación realmente implica realizar análisis moleculares que podemos usar para caracterizar microbios involucrados en remediación, minería, prevención de corrosión, y realmente nos ayuda a responder preguntas sobre sostenibilidad. Esta investigación aborda varias carencias de investigación y accesibilidad mediante el uso de flujos de trabajo biológicos moleculares fiables y portátiles en el campo, que son sencillos de usar. Destapa ambos extremos del filtro y conecta una jeringuilla de tres mililitros llena de aire al filtro usando la conexión de bloqueo luer.

Empuja el aire para expulsar el agua residual. Desconecta la jeringuilla y aspira más aire antes de repetir. Luego, recubre el tapón rojo de la salida.

Invierte la solución con una jeringuilla para mezclar. Retira la tapa de la jeringuilla de bloqueo Luer y conecta la jeringuilla Solución A a la entrada encapsulada del filtro de 0,2 micrómetros mediante la punta de bloqueo Luer. Presiona el émbolo para añadir lentamente la Solución A. Luego, agita vigorosamente el filtro cerrado durante cinco minutos.

Ahora, invierte la jeringuilla de la Solución B varias veces para mezclarla. Quita la tapa de bloqueo Luer y conecta la jeringuilla a la entrada del filtro encapsulado mediante la punta de bloqueo Luer. Después de volver a tapar la tapa del filtro de entrada, agita vigorosamente el filtro cerrado durante cinco minutos.

Quita la tapa de entrada e invierte el filtro. Utiliza una jeringuilla de tres mililitros unida a la unidad de filtro encapsulada para empujar un mililitro de aire dentro del filtro. Luego, tira del émbolo para retirar todo el lizado.

Transfiere el lisato a un tubo de perlas de cinco mililitros. Después de sellarlo con parafilm, agita vigorosamente el tubo de la perla durante cinco minutos antes de colocarlo en posición vertical. Coloca el cartucho de preparación de muestras sobre una superficie plana y coloca una columna Luer bloqueable a una jeringuilla de un mililitro.

Utiliza la punta puntiaguda de la columna para hacer dos agujeros en la primera sección del cartucho de preparación de muestras. Pipetea un mililitro de lisado desde el tubo de la perla hasta el agujero recién perforado en la primera sección del cartucho. Inserta la columna de jeringuilla de nuevo en la sección roja del cartucho.

Luego, extrae el líquido completamente dentro de la jeringuilla y luego échalo 10 veces. Ahora, coloca la punta puntiaguda de la columna de jeringuilla sobre la sección rojo-anaranjada y perfora dos agujeros a través de la barrera de aluminio. Usando el émbolo, extrae todo el volumen de líquido de la jeringuilla hasta dentro de la jeringuilla y inyecta el líquido completamente hacia fuera.

De igual modo, utiliza la columna de jeringuilla para pinchar y bombear las secciones naranja, amarilla, azul, secado al aire y verde, tirando y empujando el émbolo el número de veces que aparece en la sección. Luego, utiliza la jeringuilla de un mililitro y la columna de preparación de la muestra para transferir toda la solución de la sección verde a un microtubo de un mililitro bien etiquetado. Coloque hasta tres muestras de ADN extraídas en campo en la bandeja pura de un instrumento qPCR basado en campo, asegurando una muestra por sección designada.

Colocar las tiras de ensayo de cada muestra en las ranuras correspondientes A, B o C de la bandeja, alineando el primer pozo de cada tira con la primera ranura de la bandeja. Desbloquea el teléfono y abre la aplicación que lleva el nombre del instrumento qPCR registrado. Cuando la aplicación se abra, pulsa el botón de Iniciar.

En la siguiente pantalla, pulsa el botón Generar IDs. Introduce la información de la muestra tocando debajo de ID de muestra y escribiendo el nombre de la muestra. Toca las unidades de muestra y selecciona la unidad adecuada, luego toca debajo de la cantidad de muestra e introduce el volumen utilizado durante la extracción.

Después de introducir la información de todas las muestras, pulsa el botón Continuar. En la siguiente pantalla, toca el icono de la carpeta y luego toca Guardar en la carpeta actual. Escribe el nombre de una partida y pulsa Confirmar.

Enciende el instrumento manteniendo pulsado el botón de encendido hasta que todas las luces defronteras se iluminen. Pulsa Confirmar en la solicitud para continuar. Pulsa connect mediante inalámbrico integrado de corto alcance en la aplicación.

Pulsa el botón inalámbrico integrado de corto alcance en el instrumento hasta que parpadee la luz azul. Luego toca Confirmar y selecciona el nombre del instrumento para conectar. Quita los tapones de los tubos de la tira de go-strip para la primera muestra.

Añade 18 microlitros de agua estéril a cada pozo y haz una pipete suave para disolver el pellet. Añade dos microlitros de muestra a cada pozo y sella los tubos con tapones de tiras de ensayo de goma, asegurando la orientación correcta. Pulsa Confirmar en la solicitud una vez que todas las tiras estén listas.

Retira cada tira de ensayo. Comprueba si hay burbujas en el fondo de los pozos y luego mecía suavemente la tira hasta que suban las burbujas. Pulsa Confirmar para continuar.

Abre la tapa del instrumento y coloca las tiras de ensayo en el orden y orientación correctos. Cierra la tapa hasta que se cierre y pulsa Confirmar. Pulsa el botón Iniciar Ejecución en la aplicación para iniciar la ejecución.

Cuando termine la partida, pulsa Resultados por correo electrónico. Una vez conectado a internet inalámbrico, pulsa Enviar de nuevo para transmitir resultados. Limpia bien la bandeja entre pasadas para evitar contaminaciones.

La finalización exitosa del aislamiento de ADN utilizando el kit de extracción biológica en campo fue confirmada por resultados consistentes de qPCR en comparación con un método validado basado en laboratorio. La dilución estándar de cultivo de Dehalococcoides analizada utilizando la unidad qPCR basada en campo mostró una baja desviación en 10 repeticiones tanto a 21 como a 30 grados Celsius. Las pruebas de precisión de los instrumentos de campo mostraron una desviación estándar relativa inferior al 5% en todas las pruebas.

Así que nuestros hallazgos realmente avanzan en el campo al permitir que la monitorización ambiental se realice en estos lugares remotos, fomentando la accesibilidad, la implicación comunitaria y generando investigaciones científicas muy impactantes. Nuestros resultados allanaron el camino para entender cómo cambian las muestras durante el envío frente a la extracción y análisis inmediatos. La investigación futura se centrará en definir los límites de estos métodos para muestras extremas como la salmuera, así como para condiciones meteorológicas extremas.