Métodos para la cuantificación in situ de la morfología mitocondrial en células musculares y terminales de Schwann de ratones

Nuestra investigación investiga por primera vez la morfología mitocondrial de las células terminales de Schwann en la unión neuromuscular. Nuestro enfoque permite cuantificar la morfología mitocondrial en tejidos que de otro modo serían difíciles de obtener, como capilares y lechos linfáticos. Para empezar, obtén un tipo salvaje y un ratón D2-mdx.

Tras confirmar la profundidad anestésica por el reflejo de pellizco en el dedo del pie, inserta la aguja en el tendón distal hacia la rodilla derecha. Inyecta 50 microlitros de tinte mitocondrial fluorescente rojo lejano de dos micromolares en el interior del tibial, o el músculo TA, mientras retiras la aguja a lo largo de la trayectoria de inyección, e incuba el colorante in vivo durante una hora. Mientras mantienes al animal bajo anestesia, utiliza tijeras y pinzas para diseccionar y aislar el músculo TA antes de la eutanasia.

Coloca el músculo TA aislado en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, bajo un microscopio estereoscópico, separa suavemente las fibras mediante provocaciones. Añadir tinción de ácido nucleico permanente a la paraformaldehído al 4% para obtener una concentración final de cinco a diez microgramos por mililitro para el marcaje nuclear.

Luego, lava el músculo TA tres veces en PBS durante cinco minutos cada una para eliminar el exceso de tinte. Deshidrata el músculo secuencialmente en 50%75% y 100% etanol durante cinco minutos cada uno. Luego, incuba la muestra secuencialmente en soluciones limpiadoras de tejido uno y dos durante 30 minutos cada una, asegurándose de que queden completamente sumergidas.

Coloca el músculo en una cubierta. Utiliza un bloque de vidrio de 2,5 por 2 por 1 centímetro que pese 7,8 gramos para aplanarlo suavemente. Consigue un ratón beta S100.

Tras confirmar la profundidad anestésica mediante el reflejo de pellizco en el dedo del pie, haz una pequeña incisión en la piel sobre el músculo glúteo mayor, o GM. Inyecta 75 microlitros de tinción mitocondrial fluorescente rojo de dos micromolares bajo el músculo GM. Cierra la herida y deja que el tinte incube durante 45 minutos para marcar selectivamente las células terminales de Schwann.

Mientras mantienes al animal bajo anestesia, disecciona el músculo GM en 10 minutos y colócalo inmediatamente en solución salina estéril al 0,9% fría. Solo si se utiliza ratones de D2-mdx, añadir un colorante fluorescente del receptor de acetilcolina con una dilución de uno a 500 al baño de microdisección, e incubar el tejido durante 30 minutos. Recorta el exceso de grasa y tejido conectivo, y transfiere el músculo GM a una cubierta con el lado ventral hacia abajo para la microscopía invertida.

Añade dos microlitros de medio de montaje general sobre la superficie dorsal del GM y aplana el tejido con bloque de vidrio antes de la imagen. En el software, establece la longitud de onda de excitación a 646 nanómetros. Después de añadir dos gotas de solución de despeje dos, selecciona la lente objetivo 63X para obtener imágenes del músculo TA y ajusta la profundidad del pile Z cerca de 100 micrómetros.

Luego, selecciona el modo de deconvolución y aplica parámetros optimizados para el sistema. Ajusta el tamaño del paso a un micrómetro y adquiere imágenes. Para adquirir imágenes de las células de Schwann terminales, selecciona la lente objetivo de ampliación 20 veces, ajusta la profundidad de la pila Z a aproximadamente 17 micrómetros y adquiere imágenes.

Luego, selecciona la lente objetivo de 63 aumentos y adquiere imágenes de las células de Schwann terminales individuales. Importa cortes Z individuales para entrenar al software a reconocer la señal mitocondrial. Y realizar análisis cuantitativos utilizando software impulsado por IA.

Desarrollar máscaras de imagen para revisión por parte del investigador. Separar las pilas de imágenes 3D en secciones ópticas individuales tras la optimización del algoritmo. Selecciona cada cinco Z de cada imagen 3D y calcula la media por muestra.

Estandariza los parámetros de imagen en todas las muestras y cuantifica la morfología mitocondrial. Realizar inmunohistoquímica y análisis estadísticos para evaluar diferencias y correlaciones entre grupos. La conectividad mitocondrial se redujo en el músculo mdx en comparación con los ratones salvajes.

Se observó un mayor número de pequeños fragmentos mitocondriales y una reducción en el número de grandes redes mitocondriales interconectadas en ratones mdx. En ratones de tipo salvaje, las mitocondrias en células terminales de Schwann mostraron estructuras de bucles interconectadas cerca de bifurcaciones. En contraste, en ratones mdx, las mitocondrias parecían fragmentadas y carecían de formación de lazos cerca de las bifurcaciones.

La microscopía confocal y electrónica confirmaron estructuras mitocondriales similares en forma de donut en células terminales de Schwann. El análisis postsináptico mostró mitocondrias subsarcolemmales agrupadas alrededor de receptores de acetilcolina, sin la característica estructura similar a un pretzel. El análisis de imágenes reveló que las mitocondrias terminales de células de Schwann en el músculo mdx mostraron mayor área y fragmentación en comparación con el músculo tipo salvaje, sin diferencia en el tamaño relativo de las partículas.

Las mediciones de la fuerza muscular mostraron una reducción de la contracción con mayor variabilidad y una disminución de la fuerza máxima en el músculo MDX. La producción de fuerza a través del aumento de frecuencias de estimulación también se redujo significativamente en los músculos MDX. El músculo mdx mostró un desplazamiento hacia la izquierda en el tamaño de la fibra, lo que indica aproximadamente un 60% más pequeñas de miofibras en comparación con el tipo salvaje.

Este protocolo permite a los investigadores estudiar y cuantificar la morfología mitocondrial en el músculo esquelético y en células terminales de Schwann. Estudios futuros pueden adaptar este enfoque para investigar la morfología mitocondrial en la microcirculación y los vasos linfáticos.