Un modelo preclínico de sinopolitis utilizando tejido sinovial humano ex vivo con función y arquitectura preservadas

Las principales preguntas que queremos responder son cuál es la respuesta inmune sinovial nativa a los estímulos infecciosos e inflamatorios, y cómo se refleja eso en las alteraciones de la estructura sinovial. Mi enfoque clínico y de investigación principal es el tratamiento de pacientes mórbidamente obesos con artritis reumatoide en etapa terminal. Con frecuencia, en esta población de pacientes, han sido médicamente descuidados debido a su dificultad para encontrar opciones de tratamiento quirúrgico para su enfermedad.

Para comenzar, realice artrotomía y disección en el quirófano. Utilice un enfoque parapatellar medial estándar y realice una exposición más extensa al operar en un paciente con obesidad mórbida y osteoartritis en etapa terminal. Identifique la sinovitis anterior y use electrocauterio para diseccionar el tejido.

Observe la rodilla en busca de signos de inflamación, ya que los pacientes con obesidad pueden demostrar una respuesta inflamatoria local que se correlaciona con los efectos inflamatorios más amplios de la obesidad. Pase la sinovitis al miembro del equipo de investigación de manera estéril. Coloque el contenedor de muestras lleno de PBS de Dulbecco frío o DPBS en hielo y transfiera el tejido sinovial anterior humano adquirido durante la artroplastia total de rodilla al contenedor.

Lave el tejido dos veces en DPBS frío durante 10 minutos en una placa de oscilación. Luego, transfiera la sinovitis a una placa de Petri estéril de 10 centímetros o más grande bajo un gabinete de Nivel de Bioseguridad 2. Agregue DMEM estéril frío de bajo contenido en glucosa que contenga piruvato de sodio y L-glutamina para llenar la placa hasta la mitad.

Identifique el revestimiento sinovial por la capa íntima nacarada sin pelarlo. Organice las herramientas necesarias para obtener núcleos de biopsia de tres milímetros para un mínimo de dos réplicas técnicas. Usando tijeras de iris o un bisturí, diseccione el tejido adiposo y estromal extraneo del lado cauterizado para aislar la sinovitis, manteniendo una profundidad de tejido de aproximadamente cuatro a cinco milímetros en todo momento.

Cambie el medio del plato de Petri según sea necesario para mantener el campo de visión. Posicione el tejido con el revestimiento sinovial frente a la herramienta de perforación. Estabilice el tejido con la mano no dominante usando pinzas o hemostáticos, y perfore el tejido aplicando una presión perpendicular firme con un giro suave.

Cambiar el punzón de biopsia después de aproximadamente 10 a 15 usos, o cuando el tejido se tuerza durante la perforación para evitar dañar la estructura del revestimiento íntimo. Abra un segundo plato de Petri y llénelo con cinco a 10 mililitros de medio que contenga 10%FBS a 37 grados Celsius. Con pinzas planas o sin dientes, transfiera los núcleos al plato y agite suavemente durante uno o dos segundos para lavar los desechos sin apretarlos fuertemente.

Para preparar el pozo inferior del Sistema de Análisis de Espacio Articulado, agregue 600 microlitros de DMEM de bajo contenido en glucosa que contenga 10%FBS a 37 grados Celsius. Agregue el control de vehículo o el reactivo de tratamiento de su elección, como LPS o MCP-1, al pozo inferior. Seleccione el tamaño de poro del transwell según el resultado experimental deseado y agregue 300 microlitros de DMEM de bajo contenido en glucosa que contenga 10%FBS al transwell.

Usando pinzas estériles, transfiera suavemente los núcleos de tejido individuales al medio del transwell, evitando núcleos deshilachados y flotantes. Luego, coloque el conjunto en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante ocho a 72 horas dependiendo de los ensayos posteriores a realizar. Fije el tejido sinovial en formalina tamponada neutral al 10%.

Luego, incruste y corte para el análisis histológico. Después de teñir con hematoxilina y eosina, capture imágenes de las secciones de tejido a 10X y 40X utilizando microscopía de campo brillante. Utilice Photoshop para delinear las regiones del revestimiento íntimo y subyacente en la imagen TIFF 40X, enmascarando áreas no objetivo, eritrocitos y grandes vasos sanguíneos para el análisis cuantitativo posterior.

Analice las máscaras finales para cuantificar el grosor, la integridad y la celularidad del revestimiento íntimo y subyacente. Finalmente, evalúe las células migratorias mediante citometría de flujo y los factores solubles en el medio recolectado mediante el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. El tejido sinovial cultivado con dosis crecientes de MCP-1 o LPS mostró cambios morfológicos distintos en el revestimiento íntimo, incluyendo un revestimiento íntimo frágil y un revestimiento íntimo engrosado con una densidad celular disminuida en comparación con el control.

El tratamiento con MCP-1 y LPS alteró la respuesta citocina sinovial. MCP-1 indujo la expresión del marcador de fibroblastos patógenos podoplanina en el subrevestimiento, mientras que LPS aumentó la podoplanina tanto en el revestimiento íntimo como en el subrevestimiento. Las células inmunes migratorias en el pozo inferior incluían neutrófilos, células NK, células NKT, células T, células B, células dendríticas, monocitos o macrófagos, y macrófagos M2.

Las células T fueron las células inmunes migratorias más abundantes. Estadísticamente, no hubo diferencia en la migración celular según el estímulo del pozo inferior. La osteoprotegerina, una proteína relevante para la artritis, se detectó a las 24, 48 y 72 horas en el sinovio cultivado artrítico no tratado y fue significativamente más alta a las 72 horas que a las 24 horas.

La expresión de óxido nítrico sintasa inducible en el revestimiento íntimo fue alta en los controles a las cero horas y estuvo casi ausente después de 24 horas. La expresión de óxido nítrico sintasa se mantuvo cuando se trató con N-acetil cisteína. Por el contrario, la N-acetil cisteína no alteró la expresión de metaloproteinasa-9, un marcador tanto de sinovitis como de daño potencial del cartílago.

Este protocolo permite a los investigadores estudiar las alteraciones en las capas íntimas y subyacentes sinoviales, incluida la profundidad, la celularidad y la integridad, lo cual es indicativo de inflamación. Las consideraciones más importantes al realizar este protocolo son la adquisición de tejido viable de donantes apropiados, la esterilidad y la identificación del revestimiento íntimo para la selección de biopsia. Los estudios futuros evaluarán la mejora de la duración del cultivo de tejido viable para evaluar la regeneración del revestimiento íntimo sinovial.