Name: Un modelo preclínico de sinopolitis utilizando tejido sinovial humano ex vivo con función y arquitectura preservadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a desarrollar el sistema JSAS para modelar sinovitis humana ex vivo con arquitectura preservada. Este método permite estudiar respuestas inflamatorias agudas y mecanismos de artritis en tejido sinovial humano viable.

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<table><tbody><tr><td>10 cm Petri dishes</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>23srRNA RNAscope probe</td><td>ACD/Biotechne</td><td>468211</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>Life Sciences</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>3 mm biopsy punches</td><td>Integra</td><td>12460406</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conicals</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol (for sterilization)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borrelia burgdorferi</td><td>ATCC</td><td>35210&nbsp;</td><td>must be utilized in the late exponential phase for maximum pathogenicity</td></tr><tr><td>BSK-H</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8291</td><td></td></tr><tr><td>CD68 antibody</td><td>Invitrogen</td><td>14-0688-82</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CO2 tank (standard conditions)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate buffered saline (Ca-/Mg-)</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Biotechne</td><td>S11150</td><td>Heat inactivated Lot: F22100</td></tr><tr><td>forceps (non-toothed)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemostat</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidified cell incubator (standard conditions)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia incubator</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hypoxia tank (5% O2, 5% CO2, remainder N2, physiologic conditions)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-4 antibody</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-42470</td><td>1:100</td></tr><tr><td>iNOS antibody</td><td>Thermofisher</td><td>PA1-036</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>low glucose DMEM (+Sodium pyruvate, +L-glutamine)</td><td>Life Technologies</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>MMP9 antibody</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-32705</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Modular incubator chamber (hyperoxic conditions)</td><td>Emrbient, Inc</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>Monocyte chemoattractant protein 1</td><td>Peptrotech</td><td>300-04-20UG</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>Must be made fresh for each experiment and buffered in equimolar sodium bicarbonate to a pH of 7-7.4</td></tr><tr><td>OPG ELISA</td><td>Millipore</td><td>RAB0484</td><td>1:1 dilution</td></tr><tr><td>Oxygen tank with liter per minute flow regulator</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDPN antibody</td><td>Invitrogen</td><td>14-9381-82</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Thermofisher</td><td>J66764.MC</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope multiplex fluorescent V2 assay</td><td>ACD/Biotechne</td><td>323100</td><td></td></tr><tr><td>sRANKL ELISA</td><td>MyBioSource</td><td>MBS262624</td><td>1:1 dilution</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus USA 300 MRSA</td><td>ATCC</td><td>BAA-1717</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Thermofisher</td><td>S7563</td><td>10,000X stock</td></tr><tr><td>TNF antibody</td><td>Thermofisher</td><td>PA5-19810</td><td>1:100</td></tr><tr><td>transwell inserts - 0.4 um size</td><td>Millicell</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>transwell inserts - 5 um size</td><td>Corning</td><td>CLS3421</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo preclínico de sinopolitis utilizando tejido sinovial humano ex vivo con función y arquitectura preservadas

A Pre-Clinical Model of Synovitis Using Ex vivo Human Synovial Tissue with Preserved Function and Architecture

Optimización de las condiciones de cultivo de oxígeno
La perfusión fisiológica de tejidos es aproximadamente entre un 6% y un 8% de oxígeno, mientras que las condiciones estándar de incubación para cultivo celular son en niveles de oxígeno atmosférico (~21%)16. En comparación, la hiperoxigenación puede mejorar la viabilidad del cultivo celular o sertóxica 17. La utilización adecuada del JSAS requirió una determinación temprana de...

Un modelo preclínico de sinopolitis utilizando tejido sinovial humano ex vivo con función y arquitectura preservadas

Arthritis is an inflammatory state within joints resulting in cartilage damage, pain, and loss of mobility. Recent advances in arthritis research ...

Las principales preguntas que queremos responder son cuál es la respuesta inmune sinovial nativa a los estímulos infecciosos e inflamatorios, y cómo se refleja eso en las alteraciones de la estructura sinovial. Mi enfoque clínico y de investigación principal es el tratamiento de pacientes mórbidamente obesos con artritis reumatoide en etapa terminal. Con frecuencia, en esta población de pacientes, han sido médicamente descuidados debido a su dificultad para encontrar opciones de tratamiento quirúrgico para su enfermedad.Para comenzar, realice artrotomía y disección en el quirófano. Utilice un enfoque parapatellar medial estándar y realice una exposición más extensa al operar en un paciente con obesidad mórbida y osteoartritis en etapa terminal. Identifique la sinovitis anterior y use electrocauterio para diseccionar el tejido.Observe la rodilla en busca de signos de inflamación, ya que los pacientes con obesidad pueden demostrar una respuesta inflamatoria local que se correlaciona con los efectos inflamatorios más amplios de la obesidad. Pase la sinovitis al miembro del equipo de investigación de manera estéril. Coloque el contenedor de muestras lleno de PBS de Dulbecco frío o DPBS en hielo y transfiera el tejido sinovial anterior humano adquirido durante la artroplastia total de rodilla al contenedor.Lave el tejido dos veces en DPBS frío durante 10 minutos en una placa de oscilación. Luego, transfiera la sinovitis a una placa de Petri estéril de 10 centímetros o más grande bajo un gabinete de Nivel de Bioseguridad 2. Agregue DMEM estéril frío de bajo contenido en glucosa que contenga piruvato de sodio y L-glutamina para llenar la placa hasta la mitad.Identifique el revestimiento sinovial por la capa íntima nacarada sin pelarlo. Organice las herramientas necesarias para obtener núcleos de biopsia de tres milímetros para un mínimo de dos réplicas técnicas. Usando tijeras de iris o un bisturí, diseccione el tejido adiposo y estromal extraneo del lado cauterizado para aislar la sinovitis, manteniendo una profundidad de tejido de aproximadamente cuatro a cinco milímetros en todo momento.Cambie el medio del plato de Petri según sea necesario para mantener el campo de visión. Posicione el tejido con el revestimiento sinovial frente a la herramienta de perforación. Estabilice el tejido con la mano no dominante usando pinzas o hemostáticos, y perfore el tejido aplicando una presión perpendicular firme con un giro suave.Cambiar el punzón de biopsia después de aproximadamente 10 a 15 usos, o cuando el tejido se tuerza durante la perforación para evitar dañar la estructura del revestimiento íntimo. Abra un segundo plato de Petri y llénelo con cinco a 10 mililitros de medio que contenga 10%FBS a 37 grados Celsius. Con pinzas planas o sin dientes, transfiera los núcleos al plato y agite suavemente durante uno o dos segundos para lavar los desechos sin apretarlos fuertemente.Para preparar el pozo inferior del Sistema de Análisis de Espacio Articulado, agregue 600 microlitros de DMEM de bajo contenido en glucosa que contenga 10%FBS a 37 grados Celsius. Agregue el control de vehículo o el reactivo de tratamiento de su elección, como LPS o MCP-1, al pozo inferior. Seleccione el tamaño de poro del transwell según el resultado experimental deseado y agregue 300 microlitros de DMEM de bajo contenido en glucosa que contenga 10%FBS al transwell.Usando pinzas estériles, transfiera suavemente los núcleos de tejido individuales al medio del transwell, evitando núcleos deshilachados y flotantes. Luego, coloque el conjunto en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante ocho a 72 horas dependiendo de los ensayos posteriores a realizar. Fije el tejido sinovial en formalina tamponada neutral al 10%.Luego, incruste y corte para el análisis histológico. Después de teñir con hematoxilina y eosina, capture imágenes de las secciones de tejido a 10X y 40X utilizando microscopía de campo brillante. Utilice Photoshop para delinear las regiones del revestimiento íntimo y subyacente en la imagen TIFF 40X, enmascarando áreas no objetivo, eritrocitos y grandes vasos sanguíneos para el análisis cuantitativo posterior.Analice las máscaras finales para cuantificar el grosor, la integridad y la celularidad del revestimiento íntimo y subyacente. Finalmente, evalúe las células migratorias mediante citometría de flujo y los factores solubles en el medio recolectado mediante el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. El tejido sinovial cultivado con dosis crecientes de MCP-1 o LPS mostró cambios morfológicos distintos en el revestimiento íntimo, incluyendo un revestimiento íntimo frágil y un revestimiento íntimo engrosado con una densidad celular disminuida en comparación con el control.El tratamiento con MCP-1 y LPS alteró la respuesta citocina sinovial. MCP-1 indujo la expresión del marcador de fibroblastos patógenos podoplanina en el subrevestimiento, mientras que LPS aumentó la podoplanina tanto en el revestimiento íntimo como en el subrevestimiento. Las células inmunes migratorias en el pozo inferior incluían neutrófilos, células NK, células NKT, células T, células B, células dendríticas, monocitos o macrófagos, y macrófagos M2.Las células T fueron las células inmunes migratorias más abundantes. Estadísticamente, no hubo diferencia en la migración celular según el estímulo del pozo inferior. La osteoprotegerina, una proteína relevante para la artritis, se detectó a las 24, 48 y 72 horas en el sinovio cultivado artrítico no tratado y fue significativamente más alta a las 72 horas que a las 24 horas.La expresión de óxido nítrico sintasa inducible en el revestimiento íntimo fue alta en los controles a las cero horas y estuvo casi ausente después de 24 horas. La expresión de óxido nítrico sintasa se mantuvo cuando se trató con N-acetil cisteína. Por el contrario, la N-acetil cisteína no alteró la expresión de metaloproteinasa-9, un marcador tanto de sinovitis como de daño potencial del cartílago.Este protocolo permite a los investigadores estudiar las alteraciones en las capas íntimas y subyacentes sinoviales, incluida la profundidad, la celularidad y la integridad, lo cual es indicativo de inflamación. Las consideraciones más importantes al realizar este protocolo son la adquisición de tejido viable de donantes apropiados, la esterilidad y la identificación del revestimiento íntimo para la selección de biopsia. Los estudios futuros evaluarán la mejora de la duración del cultivo de tejido viable para evaluar la regeneración del revestimiento íntimo sinovial.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se presenta un método para evaluar la extensión espacial de las lesiones o la muerte de la célula en la superficie articular de articulaciones murinas intactas después de la aplicación de cargas mecánicas controladas o impactos. Este método puede utilizarse para investigar cómo osteoartritis, factores genéticos o los regímenes de carga diferentes afectan la vulnerabilidad de los condrocitos en situ .

Visualización en tiempo real y análisis de la lesión de condrocitos debido a cargas mecánicas en explantes de cartílago murino intacta

Aquí, presentamos un protocolo que describe el aislamiento y el cultivo de explantes de cartílago de rodillas bovinas. Este método proporciona una herramienta fácil y accesible para describir los cambios de tejido en respuesta a estímulos biológicos o nuevas terapias dirigidas a la articulación.

Un modelo de cultivo de tejido ex vivo de remodelación del cartílago en explantes de rodilla bovinas

Aquí, describimos un protocolo de citometría de flujo detallado y reproducible para identificar subconjuntos de monocitos/macrofagos y células T utilizando ensayos de tinción extra e intracelular dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial, utilizando un modelo quirúrgico establecido de osteoartritis murina.

Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis

Proporcionamos métodos detallados para generar cuatro tipos de tejidos a partir de células madre mesenquimales humanas, que se utilizan para recapitular el cartílago, el hueso, la almohadilla de grasa y la membrana sinovial en la articulación de la rodilla humana. Estos cuatro tejidos se integran en un biorreactor personalizado y se conectan a través de microfluídica, generando así una articulación de rodilla en un chip.

Creación de una articulación de rodilla en un chip para modelar enfermedades articulares y probar medicamentos

Presentamos un enfoque paso a paso para identificar y abordar los problemas más comunes asociados con las microindentaciones de microscopía de fuerza atómica. Ejemplificamos los problemas emergentes en los explantes nativos de cartílago articular humano caracterizados por varios grados de degeneración impulsada por la osteoartritis.

Abordaje de cuestiones prácticas en la microindentación basada en microscopía de fuerza atómica en explantes de cartílago articular humano

El presente estudio proporciona un protocolo modificado para aislar macrófagos sinoviales y fibroblastos del tejido de artritis inflamatoria murina.

Aislamiento y cultivo de macrófagos sinoviales primarios y fibroblastos a partir de tejido murino de artritis

Aquí, presentamos un sistema modelo ensamblado para imitar la diafonía celular del tendón entre el tejido central del tendón que soporta la carga y un compartimento extrínseco que contiene poblaciones celulares activadas por enfermedades y lesiones. Como caso de uso importante, demostramos cómo se puede implementar el sistema para investigar la activación relevante de la enfermedad de las células endoteliales extrínsecas.

Ensamblaje de tendones de ingeniería para sondear la diafonía celular en la enfermedad y la reparación

Aquí, presentamos un protocolo que establece un modelo de ratón con artritis reumatoide (AR) a través de la transferencia adoptiva de células T CD4+ de ratones SKG, proporcionando una herramienta experimental rápida y confiable para investigar los mecanismos inmunológicos, la progresión patológica y el desarrollo de nuevos tratamientos para la AR.

Un modelo adoptivo de transferencia de artritis reumatoide en ratones

En este documento, describimos un método quirúrgico para seccionar el ligamento cruzado anterior (LCA) como un modelo confiable para inducir osteoartritis de rodilla en roedores y metodologías para recolectar líquido sinovial de rodilla, medir el edema de rodilla y evaluar la gravedad de la osteoartritis.

Transección del ligamento cruzado anterior y lavado de líquido sinovial en un modelo de roedor para estudiar la inflamación articular y la osteoartritis postraumática

Un nuevo método de CC independiente para la inducción y la expansión de células T específicas de antígeno se describe. HLA A2-Ig células antígeno artificial basada en la presentación (AAPC) se cargan con el HLA-A2 péptidos restringidos a expandirse de manera eficiente CTL del antígeno específico diverso. Esta tecnología tiene un gran potencial para el CTL basado inmunoterapia adoptiva.

HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

Aprenda a desarrollar el sistema JSAS para modelar sinovitis humana ex vivo con arquitectura preservada. Este método permite estudiar respuestas inflamatorias agudas y mecanismos de artritis en tejido sinovial humano viable.

Un modelo preclínico de sinopolitis utilizando tejido sinovial humano ex vivo con función y arquitectura preservadas

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