Un método simplificado para la transformación mediada por agrobacterias de Phytophthora palmivora

Este protocolo ofrece un sistema sencillo, eficaz y reproducible para transformar Phytophthora palmivora y Phytophthora capsici. Para empezar, toma una nueva placa de barrena LB suplementada con antibióticos. Añade 20 microlitros de medio líquido LB al centro de la placa y extrae las células de agrobacterium de una placa ya crecida con un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Usando la base inferior y la base plana del tubo, distribuye las celdas uniformemente a lo largo de la placa. Incuba la placa durante la noche a 28 grados Celsius durante aproximadamente 16 a 18 horas. Después, recoge las células de agrobacterium que han crecido durante la noche usando una punta de pipeta de un mililitro.

Resuspende las células en un mililitro de medio de inducción de agrobacterium pipeteando arriba y abajo. Ahora, transfiere las células resuspendidas a un tubo estéril de 50 mililitros cubierto con papel de aluminio y añade un medio de inducción agrobacterium. Mide la densidad óptica de la muestra a 600 nanómetros y diluídala con medio de inducción de agrobacterias para lograr una densidad óptica de 0,4.

Luego afloja la tapa del tubo cubierto de papel de aluminio que contiene la suspensión bacteriana. Colócalo sobre un agitador de plataforma con una agitación suave a aproximadamente 70 revoluciones por minuto. Inundar una placa de Phytophthora palmivora de siete a ocho días con 10 mililitros de agua preenfriada a cuatro grados Celsius.

Usa una punta de pipeta para golpear suavemente la superficie y eliminar cualquier burbuja de aire en el medio. Incuba la placa a cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Luego transfiero a temperatura ambiente bajo luz durante otros 15 minutos.

Utilizando una pipeta, transfiere suavemente aproximadamente siete a ocho mililitros de zoosporas liberadas a un tubo centrífugo estéril de 15 mililitros sin alterar los micelios y esporangios. Luego transfiero 20 microlitros de la suspensión de la zoospora a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y añade 180 microlitros de agua para diluir la suspensión diez veces. Haz un vórtice en el tubo durante un minuto para insistir en las zoosporas y usa un hemocitómetro bajo un microscopio para contar las zoosporas.

Añadir cinco mililitros de la suspensión de agrobacteria preparada a cinco mililitros de la suspensión de zoospora en un tubo estéril cubierto con papel de aluminio de 50 mililitros. Mezcla suavemente el contenido, afloja la tapa del tubo y déjalo reposar a temperatura ambiente durante dos horas. Durante la incubación, prepara las placas AZCA.

Una vez que el medio se solidifica, coloca una pieza de membrana Hybond-N+ esterilizada sobre la placa y mantenla en la oscuridad. Tras dos horas de coincubación, utiliza una punta de pipeta para esparcir 300 microlitros de la mezcla sobre la membrana Hybond-N+, asegurando que los márgenes estén libres del líquido. Deja las placas de Petri sin tapar en la campana durante unos 10 minutos para que la mezcla se seque al aire.

Cuando el líquido deje de moverse sobre la membrana, cubre las placas. Incuba las placas cubiertas a 25 grados Celsius en la oscuridad durante dos días. Tras 48 horas de incubación, se utilizan pinzas esterilizadas para transferir la membrana Hybond-N+ boca abajo sobre la placa del sinfín Plich sin arrastrarla por la superficie del sinfín.

Utiliza la base plana de un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros para presionar y deslizar suavemente sobre la superficie de la membrana y asegurar un contacto total con el medio. Revisa la parte inferior de la placa por si hay burbujas de aire y presiónala suavemente usando la misma base plana. Incubar la placa a 25 grados Celsius bajo un ciclo de luz de 12 horas y un ciclo de oscuridad de 12 horas durante dos o tres días.

Finalmente, tras dos o tres días de incubación, retira la membrana con pinzas estériles y continúa incubando la placa bajo las mismas condiciones de luz y temperatura. La coincubación de zoosporas de Phytophthora palmivora con agrobacterium tumefaciens EHA 105 que expresan pCB301TOR-GFP produjo colonias resistentes a G418 en el sinfín Plich suplementadas con 30 microgramos por mililitro de G418, mientras que no aparecieron colonias en placas de control sin infección por agrobacteria. El número de transformantes resistentes a G418 por cada 10 potencias de siete zoosporas fue de 55 en el experimento uno y 50 en el experimento dos.

La microscopía de fluorescencia confirmó una señal clara de proteína fluorescente verde en transformantes de Phytophthora palmivora. Además, este protocolo se aplicó a phytophthora capsici para generar con éxito transformantes que expresan GFP. Nuestro protocolo permite a los investigadores estudiar funciones génicas, determinar la localización celular de proteínas y seguir la dinámica de la infección por patógenos.

Estos protocolos pueden generar un bajo porcentaje de falsos positivos y, por tanto, requieren enfoques adicionales para confirmar los transformantes verdaderos. La aplicación de este sistema de transformación puede extenderse a otros oomicetos y hongos. También intentaremos simplificar aún más este protocolo en el futuro.