Una plataforma novedosa para el estiramiento e imagen celular in vitro

Nuestro objetivo era desarrollar un dispositivo de estiramiento celular compatible con microscopios de bajo coste inspirado en Hoberman para investigar cómo el estiramiento mecánico influye en la función celular. Este dispositivo permite a los investigadores estudiar las respuestas de las células vitales a estímulos mecánicos, imitando sistemas fisiológicos como el latido de un corazón o la respiración de pulmones. Para empezar cuando sea apropiado el equipo de protección individual.

Mezcla la base de Silgard 184 y el agente curador en una proporción de 10 a uno en una bandeja de plástico. Con un depresor de lengua, mezcla los componentes vigorosamente durante dos o tres minutos. Luego coloca el plato en una cámara de desgasificación durante una hora.

A continuación, toma los moldes impresos en 3D preparados y añade 1,3 gramos de la mezcla de PDMS al molde isotrópico. Luego añade 0,5 gramos de la mezcla PDMS al molde uniaxial. Distribuye el gel uniformemente sobre el molde y desgasifica el molde lleno durante una hora.

Deja que el gel del molde se asiente sobre una superficie plana a temperatura ambiente durante dos horas. Luego cura el moho en un horno a 60 grados Celsius durante la noche. Después, mezcla las partes A y B del gel NuSil 8100 en proporciones iguales.

Mezclar el gel combinado con el reticulador Silgard 184 al 0,36% del volumen total para obtener una rigidez del sustrato de 13 kilopascal. Para obtener un sustrato blando con una rigidez de 0,3 kilopascal, salta añadir el reticulador y luego mezclar la solución durante 15 minutos. Coloca la mezcla de NuSil en una cámara de desgasificación y desgasifica durante 30 minutos.

Ahora retira cuidadosamente el gel PDMS del molde personalizado y colócalo sobre una cubierta de 40 milímetros sin romperla. Luego coloca el gel PDMS en el codificador de spin. Pipetea 100 microlitros de la mezcla NuSil sobre la zona negativa del gel isotrópico PDMS.

Luego pipeteo 50 microlitros de la mezcla NuSil sobre la zona negativa del gel PDMS uniaxial. Después de ese código, siete G durante 50 segundos. Para alcanzar un grosor de 100 micrómetros.

Deja que el gel recubierto se asiente sobre una superficie plana y nivelada a temperatura ambiente durante dos horas. Coloca el gel en un horno y cura a 60 grados Celsius durante la noche. Ahora siembra las vías respiratorias humanas, las células musculares lisas en pozos de cultivo elástico y las incuban bajo condiciones estándar.

Después, mezcla las células con la solución de calcio FLIPR Calcium 6 para la imagen. Para la medición de la fuerza de tracción, recubre los sustratos del gel NuSil del PDMS con una capa de perlas fluorescentes que sirvan como marcadores fiduciales. Preparar una solución al 0,025% de microsferas modificadas con carboxilato fluorescente rojo de un micrómetro de diámetro en HBSS.

Usando un mezclador de vórtices para hacer la solución de la perla durante 10 segundos. Luego pipeteo 880 microlitros de la solución de la perla hasta el gel isotrópico. Añade 420 microlitros de la solución de perlas al gel uniaxial.

Tras incubar el gel a temperatura ambiente durante una hora, retira cuidadosamente la solución de la perla para preservar la distribución de las cuentas. Luego usa un hisopo de algodón o una toallita de laboratorio para secar suavemente cualquier solución residual de la superficie del gel. Después, utiliza un microscopio invertido equipado con cámara, motor ligero y un objetivo seco 10 veces.

Ajusta la excitación a 475 por 40 nanómetros y la emisión a 555 por 50 nanómetros. Adquirir imágenes de 16 bits a una tasa de fotogramas de dos hertz durante experimentos de estiramiento. Ahora coloca gel isotrópico en la estiradora y luego fotografía las perlas fluorescentes usando un microscopio invertido equipado con un objetivo seco 10 x. Captura imágenes en condición de preestiramiento.

Captura imágenes de forma continua a lo largo del protocolo de estiramiento en el centro del sustrato. Reenfoca el microscopio en la posición estirada si es necesario antes de capturar imágenes. Analizar las imágenes utilizando código personalizado de MATLAB basado en la microscopía de fuerza de tracción de Furier para calcular los vectores de desplazamiento y los correspondientes campos de deformación planar.

Representa los datos como la media de los ensayos finales. Aplicar un desplazamiento de 240 micrómetros hacía que las perlas fluorescentes se desplazaran radialmente hacia afuera desde el centro. La microscopía de fuerza de tracción reveló un campo de desplazamiento isotrópico con vectores que irradiaban desde el centro y aumentaban en magnitud con la distancia.

El campo de desplazamiento isotrópico generó un campo de deformación planar homogéneo. Aumentar el desplazamiento a 1000 micrómetros resultó en vectores de desplazamiento que aumentaron en magnitud manteniendo la orientación radial. El campo de deformación correspondiente a 1000 micrómetros aumentó en magnitud mientras permanecía radialmente simétrico.

En geles uniaxiales sometidos a un desplazamiento de 250 micrómetros, los vectores de desplazamiento se alineaban predominantemente a lo largo de un solo eje, consistente con la deformación uniaxial. Las formas de onda de deformación reflejaban de cerca los desplazamientos programados de los motores y permanecían sincronizadas a lo largo de tres ciclos repetidos. Los valores de deformación en el desplazamiento máximo se mantuvieron consistentes en tres muestras independientes.

Aplicar un desplazamiento transitorio de hasta 5.555 micrómetros produjo deformaciones que iban desde más del 0,1% hasta el 12%. Una deformación transitoria del 0,5% inducía un aumento del calcio intracelular, evidente como una mayor intensidad de fluorescencia tras el estiramiento. Utilizando nuestra camilla, los investigadores pueden realizar imágenes de calcio con células vivas, microscopía de fuerza de tracción y cuantificar respuestas mecánicas celulares a estiramientos isotrópicos o uniaxiales. Un paso crítico es asegurarse de que los geles curen en una superficie nivelada, ya que un grosor desigual puede desenfocar el sustrato y reducir la claridad óptica durante la imagen en vivo.

Estudios futuros pueden investigar la reorientación del citoesqueleto inducida por estiramiento, condiciones patológicas de la tensión relacionadas con el asma o la lesión pulmonar, y en diversos tipos celulares.